重组腺病毒介导的基因转移系统的建立以及在离体及活体中表达

首先建立了重组腺病毒载体介导的基因转移系统：将质粒ｐＡｄＣＭＶｌａｃＺ用磷酸钙沉淀法转移至２９３腺病毒包装细胞中，经挑克隆、病毒扩增、纯化、浓度和滴度测定，制备了纯化的病毒颗粒ＡｄＣＭＶｌａｃＺ；以此感染离体细胞，ｌａｃＺ基因转移效率可达９０％￣９５％；小鼠被直接活体注射重组的腺病毒ＡｄＣＭＶｌａｃＺ，ｌａｃＺ基因能够在多种组织中表达。其次，运用重组腺病毒介导的基因转移系统，进行了人凝血因子ⅨｃＤ     

血友病B基因治疗临床试验的安全性研究

报道了血友病Ｂ基因治疗临床Ｉ期试验的安全性研究，包括反转录病毒基因的ＤＮＡ聚合酶反应（ＰＣＲ）、反转录ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）、Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交以及ｎｅｏ基因和ｌａｃＺ基因的补求分析（ｒｅｓｏｕｅａｓｓａｙ）．从ＤＮＡ水平，ＲＮＡ水平和病毒活性体水平对野生型病毒进行了检测，没有检测到反转录病毒，并对兔和人转基因细胞进行形态学观察，染色体核型分析，软琼脂实验，裸鼠接种实验，兔和裸鼠的病理检测及电镜分     

猪瘟病毒E2基因pGEME2重组质粒仍具有α互补作用

在利用ＰＧＥＭ－Ｔ载体克隆猪瘟病毒石门株Ｅ２基因中发现，Ｅ２基因以与ｌａｃＺ相同方向插入时，重组质粒仍具有α互补作用，叶典型的蓝色菌落，而以与ｌａｃＺ基因相反方向插入时，重组质粒无α互补作用，呈白色菌落，经Ｅ２蛋白检测、序列分析、重组质粒缺失和插入等研究，结果表明，ＰＧＥＭＥ２的α互补作用产生机制不同于目前人们已知的机制，它由外源Ｅ２基因内部起始合成新的α肽，从而赋于其α互补作用，此结果表明利用α     

卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

紫云英根瘤菌结瘤基因调控片段克隆和分析

通过对紫云英根瘤菌７６５３Ｒ及其Ｎｏｄ－突变株７６５３Ｒ－１侵染根毛试验证实,７６５３Ｒ菌株３１８×１０３ｂｐ大质粒决定早期结瘤功能,分子杂交结果显示,其ｎｏｄＤＡＢＣ定位于该质粒上．将７６５３Ｒ菌株的大质粒ＤＮＡ进行酶切并克隆到表达载体ｐＭＰ２２０上,构建ｌａｃＺ重组子文库,将ｌａｃＺ重组子文库导入７６５３Ｒ菌株,在加有Ｘ－ｇａｌ和种子浸提物的根瘤菌培养基上选择蓝色菌落．通过Ｍｉｌｅｒ试验测定它们的β－半乳糖苷酶活性,获得１株种子浸提物对其有诱导效应的菌株ＨＮ１８,对该菌株所含的重组质粒ｐＨＮ１８进行ｎｏｄＤＡＢＣ探针杂交,发现有１条１．７×１０３ｂｐ的阳性杂交带,说明在ｐＨＮ１８中克隆有结瘤基因启动子     

科学级冷却型CCD—荧光图像系统定量性能的鉴定

以荧光探针Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｈｏ３３３４２）特异性标记大白鼠精子和肝细胞ＤＮＡ，用科学冷却型ＣＣＤ显微荧光图像系统获取单个细胞的荧光图像，再以图像处理软件“Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ ＰＬｕｓ”，分析测量各细胞的ＤＮＡ相对含量和细胞核的相对面积。实验数据表明：鼠肝细胞的ＤＮＡ相对含量分别为精子的ＤＮＡ相对含量的２，４，８倍，符合生物学的规律，说明这套系统的定量结果是可靠的。     

氧和葡萄糖对啤酒酵母细胞核基因pet54表达调控的研究

为研究氧和葡萄糖对ｐｅｔ５４基因表达的调控，构建了ｐｅｔ５４：ｌａｃ Ｚ融合基因，用于监测有呼吸的二倍体菌株中ｐｅｔ：５４基因的表达，实验结果表明氧促进ＰＥＴ５４基因表达，葡萄糖阻遏ｐｅｔ５４基因表达。     

非放射性标记ZF_3，ZF_4特异性探针对奶牛DNA杂交判断奶牛性别

在测定了奶牛ＺＦＸ和ＺＦＹ基因的部分序列基础上，设计出两条分别特异于ＺＦＸ及ＺＦＹ的探针（ＺＦ＿４）及（ＺＦ＿３），同时也是两条引物。采用非同位素方法（ＤＩＧＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ３＇ｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇｋｉｔ）标记两条探针，并对ＺＦＸ，ＺＦＹ两个克隆子进行杂交，对以雄性奶牛和雌性奶牛的杂色体基因组ＤＮＡ为模板以ＺＦ＿１和ＺＦ＿２￣［１］为引物的ＰＣＲ产物进行杂支，结果表明ＺＦ＿３特异于ＺＦＹ，ＺＦ＿４特异于ＺＦＸ基因。并以该两条探针对不同浓度梯度的ＤＮＡ模板的ＰＣＲ产物进行点杂交，结果表明ＺＦ＿３和ＺＦ＿４对ＰＣＲ的产物的杂交来判断奶牛性别其灵敏度可达到８ｐｇＤＮＡ量的水平。     

带权解析函数空间Z_p~p的刻画

研究了Ｏ．Ｓｌａｓｃｏ和ＤｅＳｏｕｚａ定义的一个解析函数空间Ｚ，利用Ｈａｄａｍａｒｄ乘积方法，得到了这个函数空间的一个完全刻画．特别地得到了Ｂｌｏｃｈ函数的一个新特征．     

带权解析函数空间Z^PP的刻画

研究了Ｏ．Ｓｌａｃｏ和ＤｅＳｏｕｚａ定义的一个解析函数空间Ｚ＾ＰＰ，利用Ｈａｄａｍａｒｄ乘积方法，得到了这个函数空间的一个完全刻画，特别地得到了Ｂｌｏｃｈ函数的一个新特征。     

缺铁玉米根cDNA文库的构建及蛋白和cDNA差异比较

采用异硫氰酸胍酚氯仿法分离铁胁迫玉米根总ＲＮＡ,然后采用寡聚ｄＴ 纤维素层析柱法纯化Ｐｏｌｙ（Ａ） ＋ ＲＮＡ．用含有ＸｈｏＩ位点的ｌｉｎｋｅｒｐｒｉｍｅｒ 锚定合成ｃＤＮＡ 第一条链后,采用替代法合成第二条链,接着连接上ＥｃｏＲＩＡｄａｐｔｅｒ 以便定向重组到载体上．ｃＤＮＡ 经过ＸｈｏＩ消化和分级分离后,带有ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ粘性末端的ｃＤＮＡ 定向重组到λＺＡＰ表达载体的ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ位点上．经体外包装,重组的噬菌体转导宿主菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ,最终获得滴度为４－５ ×１０５ ｐｆｕ／ｕｇ 的λＺＡＰ 表达ｃＤＮＡ 文库．通过差异筛选法和质膜双向电泳验证了缺铁和加铁条件下ｃＤＮＡ 和质膜蛋白的差异     

家蚕核多角体病毒双穿梭载体的构建及GFP和HBeAg融合蛋？…

用ＡｃＮＰＶ穿梭载体Ａｃ－Ｂａｃｍｉｄ与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞。通过同源重组得到整合了ｌａｃｚ／Ｔｎ７ａｔｔ／ｍｉｎｉＦ表达盒的ＢｍＮＰＶＢａｃｍｉｄ,除能在大肠杆菌／ＢｍＮ细胞中穿梭复制外,还以感染ＢｍＮ－ＰＶ的非允许     

用微弹轰击法将GUS基因导入香蕉茎尖组织细胞

用在弹轰击法将外源ＤＮＡ导入香蕉（Ｍｕｓａ，ｓｐｐ）茎尖细胞，以ＧＵＳ基因作为报告基因，用Ｘ－Ｇｌｕｃ浴液对ＧＵＳ基因表达产物进行组织化学鉴定。样品材料细胞中发现有明显的蓝色斑点，而对照则没有。实验说明用微弹轰击法可以将外源基因导入香蕉茎尖组织并在其中成功表达，这为香蕉的外源基因导入工作提供了新的有效途径．     

HVTG非必需基因区鉴定及含MDVgB基因重组病毒的构建

以火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）约８．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ ＤＮＡ克隆片段中的ＢａｍＨＩ ＨｉｎｄⅢ亚克隆片段为同源序列,将大肠杆菌β－半乳糖苷酶（ＬａｃＺ）基因作为报告基因,通过同源重组,获得了表达ＬａｃＺ基因产物的重组ＨＶＴ（ＬａｃＺ－ｒＨＶＴ）。经本内,体外传代表明重组病毒中的ＬａｃＺ基因表达稳定,同时证明该亚克隆片段属于ＨＶＴ复制的非必需基因。在此基础上,将Ｉ型马立克氏病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｂ（ｇＢ）     

蟾蜍（Bufo japonicus）细胞溶素基因筛选用探针的制备

利用阴离子交换、凝胶过滤和高压液相柱层析对细胞溶素基因进行了纯化，获得了纯度极高的酶样品。经ｌｙｓｉｌ内肽酶进行定点酶切后，利用高压液相柱层析纯化出了该酶的多个短肽片段。其中，经测序获得了３个短肽片段的氨基酸序列。根据两栖动物中密码子的使用频率，可推测出其相应的ｃＤＮＡ的核苷酸序列，进而制备出了３个ｃＤＮＡ探针。利用这些合成的探针，便可从精子ｃＤＮＡ文库中筛选细胞溶素基因。     

Quox—1基因同源序列在豚鼠精子形成中的表达

以地高辛标记的Ｑｕｏｘ－１基因ｃＤＮＡ的ｃ３片段为探针，与豚鼠基因组ＤＮＡ作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果表明，在豚鼠基因组中存在Ｑｕｏｘ－１基因同源序列，以抗ＱＵＯＸ－１蛋白的特异性抗体对成年豚鼠睾丸，附睾和幼年豚鼠睾丸的组织切片进行免疫组织化学分析，发现在豚鼠精子发生中精子细胞分化为精子阶段有类ＱＵＯＸ－１蛋白提示Ｑｕｏｘ－１基因同源序列可能对豚鼠精子发生中的精子形成过程有调控作用。     

植酸酶基因表达与调控机制研究(Ⅱ)──番茄幼苗cDNA文库构建与植酸酶基因筛选

采用异硫氰酸胍法从发芽３～４ｄ的番茄幼苗中提取出总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素亲和层析分离纯化ｍＲＮＡ．以ｍＲＮＡ为模板,Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物用逆转录法合成双链ｃＤＮＡ．将ｃＤＮＡ与ＥｃｏＲＩ接头连接后克隆到表达载体λｇｔ１１的单一ＥｃｏＲＩ位点,经体外包装后感染宿主菌Ｙ１０９０,成功地构建了完整的番茄幼苗ｃＤＮＡ文库．用颜色筛选法筛选重组子,然后用植酸酶抗体做探针进行免疫筛选,得到两个阳性克隆．挑取阳性克隆噬菌斑扩增后纯化ＤＮＡ,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,显示确有外源ＤＮＡ存在．该插入片断序列测定正在进行．     

乙型肝为病毒（HBV）DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游,重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达,用纯化后的重组质粒直接注射用ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼细内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体,ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合。     

紫云英根瘤菌5个互补结瘤菌株所分离到的重组质粒外源片 …

对来源于紫云英根瘤菌７６５３Ｒ总ＤＮＡ基因文库的５个互补结瘤菌株所分离到的重组质粒ｐＮＲ１０２，ｐＮＲ１０３，ｐＮＲ１０８，ｐＮＲ２０３和ｐＮＲ２１３，ＥｃｏＲＩ酶切表明它们分别携带有一个４．６８，５．０１，５．０４，５．１０或９．３８ｋｂ的外源ＤＮＡ片段。选用１１种内切酶进行单、双酶切分析，建立了重组质粒外源片段的酶切图谱，５个质粒都具有１．７ｋｂ的ＥｃｏＲＩ－ＢｇｌⅡ片段和１．９ｋｂ的ＥｃｏＲ     

乙型肝炎病毒(HBV)DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游．重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达．用纯化后的重组质粒直接注射到ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼肌内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体．ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合