电脉冲激活猪卵母细胞的研究

通过对猪卵母细胞的电激活进行系统研究，结果表明：对于体外成熟母卵细胞，电场强度为１２５０Ｖ／ｃｍ，脉冲时程为４０，６０μｓ时，效果较好，一次脉冲激活率可达８５．３％和８７．１％，而对于体内成熟卵母细胞，电场强度为１５００Ｖ／ｃｍ，脉冲时间为４０，６０μｓ时，效果了，一次脉冲激活率达８５．７％和８８．２％；     

牛卵母细胞不同时间的成熟培养可提高核移植效率

：比较了成熟培养不同时间的卵母细胞的成熟率、去核率及用于核移植的效率,认为成熟培养21 h的卵母细胞虽然有较高的成熟率,但不适于采用盲去法去核.成熟培养19 h的卵母细胞核移植效率略高于成熟培养17 h.因此认为采用盲去法去核操作大批卵母细胞时,19 h的体外成熟培养时间是比较适宜的.     

猪卵核移植的研究

以湖北白猪为受体，杜洛克为供体进行了猪卵核移植的研究。结果表明，半胱氨酸对卵具有保护作用。卵龄对核移植效率有显影响，以４２－４８ｈ为宜，激活后卵母细胞做受体可提高移核胚的发育率；供体核发育期对移核胚的发育有显影响。核移植后的重组胚移入受体后，经体内发育得到了５只核移植仔猪。     

卵母细胞老化对小鼠体细胞克隆胚发育的影响

就小鼠卵母细胞的卵龄对克隆胚的体外发育能力的影响进行了检测,以确定最佳的取卵时间,以及取卵后进行核移植操作的可耐受的时间。采用PMSG和hCG超排B6D2F1雌鼠。在体内老化实验中,分别于注射hCG后13,15,17,20h取卵用于核移植操作;在体外老化实验中,所有的卵均于注射hCG后13h取出并培养,然后在13,15,17,20h进行核移植操作。每个时间点的核移植操作在1h内完成,重构的胚胎培养1h后进行激活。结果显示:在体内老化实验中,注射hCG后13h取卵,获得的克隆囊胚发育率最高,为56.0%,15h取卵仍维持了其支持胚胎体外发育的能力,但17h及更长时间后取的卵,重构后的囊胚发育率显著下降(18.1%)。注射hCG后15h取的卵孤雌发育率最高(囊胚发育率为90.1%),并在17h仍维持较高的孤雌发育能力,在20h显著下降。在体外老化试验中,于注射hCG后13h取卵,分别于13,15,17h重构,都获得了较高的囊胚发育率(分别为57.7%,52.2%,46.3%),而在注射hCG后20h重构,囊胚发育率显著下降(14.8%)。体外老化的孤雌胚在注射hCG后22h激活时囊胚发育率显著下降。结果表明:卵母细胞在体内和体外老化都影响克隆胚的体外发育,最佳取卵时间为注射hCG后13h,取卵后立即用于重构可获得最佳囊胚发育率;体内、外老化卵支持重构胚较好发育的时间间隔是不同的,体内老化卵支持重构胚发育能力从注射hCG后17h开始下降,体外老化卵则发生在20h。这些结果可以指导操作,有利于在应用核移植进行其他基础研究时降低操作引起的误差。     

猪卵母细胞体外成熟的研究

从屠宰场收集卵巢,用注射器从卵泡中吸出卵丘－卵母细胞复合体,对猪卵母细胞体外成熟的条件进行研究,根据卵母细胞体外成熟时的核成熟率、胞质成熟及体外受精时精子的穿卵速度,合适的体外成熟培养时间为４２～４５ｈ．卵母细胞周围卵丘细胞的多少及其排列紧密状态与卵母细胞的体外成熟率密切相关。卵泡大小与卵母细胞的体外成熟率有关,大卵泡卵优于小卵泡卵。ＰＭＳＧ促进猪卵母细胞体外成熟。     

昆明白小鼠卵母细胞的生发泡移植

为探讨细胞核与细胞质调控减数分裂的机制，对昆明白小鼠GV期卵母细胞进行了GV移植研究．将6～8周龄小鼠GV期卵母细胞分别与6～8周龄和3月龄小鼠GV期卵母细胞进行GV互换，所形成的3种GV～胞质体复合体的融合率(85．0％～89．8％)和3种重组卵母细胞的成熟率(93．9％～96．2％)并不因小鼠年龄的改变而有所变化．经人工活化后，3种重组卵母细胞形成原核期胚和2-细胞期胚的比率(分别为80．5％～85．4％和51．2％～55．4％)也不因不同年龄小鼠卵母细胞所带来的细胞质或细胞核的改变而受到影响．细胞遗传学分析表明成熟的重组卵母细胞表现出正常的核型．     

切割采卵法及牛卵巢深层卵泡卵母细胞的体外受精

为提高牛体外受精(BIVF)过程中屠宰牛卵巢的利用率,本研究将采集的110个牛卵巢先用常规的注射器抽吸法采卵后,再用刀片切割法采集了位于深层的卵泡卵母细胞,并对两种方法回收的卵子分别进行了BIVF实验。结果表明,在先用抽吸法采卵每头牛可得到9.88±2.42枚可用卵子的基础上,切割法采卵又可获得平均8.74±3.48枚可用卵子。这使得平均采卵数达到了每头牛18.62±2.59枚。体外受精后,由切割法回收的深层卵子其卵裂率和桑椹胚、囊胚发育率分别为43.01％(160/372),14.24％(53/372)和10.48％(39/372),均明显低于抽吸法回收卵的73.62％(201/273)、31.14％(85/273)和19.05％(52/273),(P<0.01)。本研究证明了抽吸后再切割的两次采卵法对提高牛卵巢采卵效率有着明显的效果,而且这部分深层卵泡卵母细胞用于体外受精后可发育为正常的早期胚胎,但各项发育指标尚有待于进一步提高。     

卵母细胞的不同对牛体外受精效果的影响

为了进一步提高牛体外受精（ＢＩＶＦ）胚的发育率，探讨了来自不同大小卵泡、具有不同卵丘细胞层数以及细胞质形态不同的卵母细胞对牛体外受精效果的影响。结果表明：１）分别采自直径大于５ｍｍ、２￣５ｍｍ和小于２ｍｍ的卵泡的卵母细胞，经体外成熟、体外受精后，卵裂率分别为５４．５％（３０／５５）、６４．４％（８５／１３２）和５０．４％（６３／１２５）。其中，２￣５ｍｍ卵泡的卵母细胞的体外受精结果显高于小于２ｍ     

猪卵母细胞生长成熟过程中脂质成份的研究

本实验应用Ｃａｔａｌａｎ及Ｌｉｌｌｉｅ氏油红Ｏ染色法和Ｂａｋｅｒ氏酸性氧化苏木精染色法，对猪卵母细胞生长成熟过程中脂质成份的改变情况进行了染色研究，把生长卵泡按其直径：０．８～２．４ｍｍ（Ｓ组）、２．５～４ｍｍ（Ｍ组）、＞４ｍｍ（Ｌ组）分为三组，分别取其中的卵母细胞进行染色观察．另外，还作了卵巢冰冻切片的染色观察．结果表明，在卵泡腔形成之前的猪卵母细胞中就含有大量的脂滴，在卵泡形成时，卵母细胞内的脂滴有所增加．脂滴中含有中性脂肪和磷脂．     

季节对猪体外成熟卵母细胞的发育能力的影响

猪的卵母细胞对外界环境非常敏感,这造成猪的胚胎学相关研究是家畜繁殖学研究领域中最困难的方面之一.文章的研究目的是描述季节的变化对体外成熟卵母细胞发育能力的影响.研究中比较了不同季节每对卵巢获得A/B级卵的数量以及卵母细胞核成熟的比例(实验1),另外统计分析了不同季节孤雌(实验2)和核移植(实验3)胚胎发育能力的差异,最后在冬春两季分别进行了克隆胚胎的移植以观测其体内发育情况(实验4).结果显示实验1,春季(3月到5月)COCs/卵巢的比例最高(7.6±3.5),夏,秋,冬季的比例依次是(6.4±3.3),(6.7±2.9),(6.7±3.4),p<0.05.然而,没有发现卵母细胞的MⅡ比例有显著性差异((75.3±3.3)%,(73.5±2.3)%,(73.0±4.2)%,(76.5±6.7)%,依次是春,夏,秋,冬季的MⅡ比例,p<0.05).实验2,观察到夏季孤雌胚胎的囊胚率显著性降低(10.1±2.6)%,春,秋,冬季的孤雌胚胎囊胚率依次是(27.2±3.4)%,(22.4±3.5)%,(22.4±3.4)%,p<0.05.实验3,猪体细胞克隆胚胎在春季囊胚率获得提高((12.2±1.3)%,秋,冬季的克隆胚胎囊胚率依次是(10.2±1.2)%,(8.1±1.4)%,p<0.05).实验4,发现冬季胚胎移植无论是妊娠率还是出生率都明显低于春季.以上结果表明季节变化影响体外成熟卵母细胞的发育能力.     

猪体外成熟卵母细胞凋亡的形态观察

将猪成熟卵母细胞直接放入NCSU23培养液中培养,通过形态观察和Hoechst33342染色,并与孤雌激活卵子对照,探明猪体外成熟卵母细胞凋亡的规律.在未激活组中,胞质不均匀分裂是主要的趋势,高于坏死和胞质均匀分裂;胞质不均匀分裂在24 h出现,在24～96 h时间段有较大的增幅,最高胞质不均匀分裂率出现在132 h;胞质均匀分裂在12 h出现,在24～72 h时间段有较大的增幅,最高胞质均匀分裂率出现在120 h,之后略有下降;坏死在12 h出现并持续增加,在24～108 h增幅较大,180 h坏死率为28.6%.孤雌激活组中,胞质均匀分裂是主要趋势,但60 h后坏死率高于胞质不均匀分裂;胞质均匀分裂在12 h出现,在24～60 h时间段有较大的增幅,最高胞质均匀分裂率出现在60 h,并出现了5.6%的囊胚率;胞质不均匀分裂在24 h出现并持续增加,在24～72 h时间段有较大的增幅,180 h的胞质不均匀分裂率为15.4%;坏死在12 h出现,在24～108 h增幅较大,180 h之间的坏死率为39.6%.未激活组胞质不均匀分裂形态明显高于孤雌激活组,96h后差异显著(p《0.05);孤雌激活组胞质均匀分裂形态高于未激活组,60h后,两组差别显著(p《0.05);孤雌激活组坏死形态高于未激活组,96 h后两组出现明显差异(p《0.05).     

瘦素对猪卵母细胞体外成熟及克隆猪妊娠率的影响

体细胞克隆猪在人类医学、基础科学研究和畜牧业生产方面均具有很大的应用潜力.为了提高体细胞克隆猪的效率,首先比较了两种基础成熟液NCSU-23和TCM199的体外成熟效果,然后在TCM199培养液的基础上,较系统地研究了添加不同浓度的瘦素对猪卵母细胞成熟、孤雌激活胚胎和克隆胚胎的体外发育以及克隆胚胎体内发育的影响.结果表明:成熟液中添加100ng/mL或200ng/mL瘦素对猪卵母细胞的核成熟没有显著影响(P>0.05);对孤雌激活卵裂率和克隆胚胎卵裂率也没有显著影响(P>0.05);但却显著提高了孤雌激活胚胎的囊胚率和囊胚细胞数,并且显著提高了克隆胚胎的囊胚率;当添加量为100ng/mL时,克隆囊胚的细胞数显著升高.另外,研究表明,瘦素很可能具有提高克隆胚胎移植妊娠率和妊娠到期率的作用.     

猪卵母细胞第一极体排出与否对其早期胚胎发育的影响

探讨猪卵母细胞第一极体排出与否对其体外受精和孤雌激活后早期发育的影响．从屠宰场收集猪卵巢卵母细胞,体外成熟培养42-46h后分为3组：排出第一极体组、没有排出第一极体组和对照组（不挑选第一极体卵母细胞）,进行体外受精或化学孤雌激活之后放入胚胎培养液进行体外培养,分别于第48h和第168h统计分裂率和囊胚率．①体外受精后,有极体组的卵裂率略高于无极体组和对照组的卵裂率（62．19％&#177;6．99％vs55．40％&#177;6．80％和56．33％&#177;8．17％）,各组间没有显著差异（P〉0．05）;囊胚率分别为4．87％&#177;3．77％,2．33％&#177;1．34％和3．50％&#177;2．96％,有极体组明显高于无极体组（p〈0．05）,对照组与其它两组没有显著差异（p〉0．05）．②化学激活后,有极体组的卵裂率高于无极体组和对照组（75．45％&#177;1．35％vs64．81％&#177;2．07％和69．64％&#177;2．51％,p〈0．05）;有极体组的囊胚率也高于无极体组和对照组（24．54％&#177;4．34％vs12．96％&#177;3．99％和18．75％&#177;1．87％,p〈0．05）．排出第一极体卵母细胞比没有排出第一极体卵母细胞的发育能力强,但没有排出第一极体卵母细胞经体外受精或人工激活后也可以发育到囊胚阶段．     

促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响

利用促减数分裂甾醇(MAS)合成代谢过程中的抑制剂AY9944累积FF-MAS的原理,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944,间接地研究了内源性MAS对猪卵母细胞体外成熟质量的影响.猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)培养在NCSU23成熟培养液中,并添加不同浓度(0,10,20,40μmol/L)的AY9944培养44h.培养结束后,成熟的卵母细胞进行孤雌激活和以胎儿成纤维细胞为核供体重构胚胎,分别于48和144h观察胚胎发育情况,统计卵裂率和囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率.结果如下:(1)随着AY9944添加浓度的增加,退化的卵母细胞增多,40μmol/L AY9944处理的退化卵显著,卵母细胞成熟率显著下降.(2)成熟培养液添加20和40μmol/L AY9944处理的孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(P<0.05).(3)以对照组(0μmol/L AY9944)和20μmol/L AY9944处理的卵母细胞为胞质受体,发现20μmol/L AY9944处理的克隆胚的发育能力囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率有所提高,但无显著差异(P>0.05).以上结果表明,猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944提高了猪卵母细胞体外成熟的胞质质量,胚胎的发育能力提高.     

猪体外成熟卵母细胞激活方法的比较

研究了离子霉素/6-二甲氨基嘌呤(DMAP),乙基汞硫代水杨酸钠/二硫苏糖醇(DTT)激活猪体外成熟卵母细胞的最佳条件,比较研究了电脉冲和化学刺激对猪体外成熟卵母细胞的激活效率.结果表明,用15μmol/L离子霉素处理猪体外成熟卵母细胞10,20,30,40,50,60和70min,其囊胚发育率差异不显著,以40min时的囊胚发育率最高.用15,20和25μmol/L离子霉素处理猪体外成熟卵母细胞,其囊胚率无显著差异.用100,200和300μmol/L乙基汞硫代水杨酸钠分别激活猪体外成熟卵子,发现100μmol/L乙基汞硫代水杨酸钠中处理30min组的卵裂率和囊胚率最高.电脉冲与两种最佳化学激活组的比较研究表明,电激活组的囊胚率最高,但囊胚细胞数低,相反,乙基汞硫代水杨酸钠/二硫苏糖醇激活组的囊胚细胞数最高,囊胚率却较低.     

猪卵母细胞体外成熟及电激活后发育能力的研究

探讨了不同的成熟培养液及外源激素对猪卵母细胞体外成熟培养及电激活后孤雌胚胎发育能力的影响. 结果表明：（1）改良M199（mM199）组猪卵母细胞成熟率显著高于M199组，且这两组又较NCSU-23组能极显著提高卵母细胞的成熟率. （2）孕马血清（PMSG）+人绒毛膜促性腺激素（hCG）+促卵泡素（FSH）组卵母细胞成熟率略高于FSH+促黄体素（LH）组，两者卵母细胞成熟率极显著高于尿促性腺激素（hMG）组. （3）含胎牛血清（FBS），猪卵泡液（PFF），表皮生长因子（EGF）的培养液较对照组在卵母细胞成熟率上无显著差异，但均能显著提高电激活后的卵裂率.添加EGF组桑囊率明显高于不添加组.但分别添加FBS和PFF组较对照组在桑囊率上均无显著差异. （4）卵丘细胞扩散与卵母细胞第一极体排出之间无直接相关性，但扩散程度好能提高电激活后的卵裂率.     

细胞松弛素B、温度、离心处理对猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻的影响

主要探讨使用CB预处理和不同温度冷冻保护剂对猪卵母细OPS玻璃化冷冻保存的影响,并对使用不同温度冷冻保护剂下,探讨离心猪卵母细胞后的OPS冷冻、解冻的效果.结果表明,体外成熟培养12h后,将经7.5μg/mL细胞松弛素B(CB)处理的猪卵母细胞进行OPS玻璃化冷冻保存.解冻后继续体外成熟培养,猪卵母细胞的形态正常率和成熟率与对照组无显著差异(P>0.05),但是与对照组相比,经冷冻前经CB预处理的卵母细胞其体外受精胚胎的卵裂率、桑葚胚和囊胚率显著提高(P<0.05).此外,使用预平衡至39℃的冷冻保护剂能够达到较好的解冻效果,卵母细胞成熟率较高,但离心并没有促进冷冻后猪卵母细胞体外受精胚胎发育率.     

猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究

对不同体外成熟培养时间的猪卵母细胞进行盲吸法去核及利用脱羧秋水仙碱(DC)和放线菌酮(CHX)的化学诱导法去核效率进行了比较研究.用盲吸法去核,体外成熟培养(IVM)39~41 h组卵母细胞去核率与IVM 36~38 h组差异显著(P<0.05),与42~44 h组差异不明显(P>0.05),但3组显著高于IVM 45~48 h组(P<0.05).化学诱导法去核结果,IVM 42~44 h组去核率最高,但与IVM 39~41 h组差异不显著(P>0.05),其他各组间均差异显著(P<0.05).在相同的体外成熟培养时间内,盲吸法的去核率比化学诱导法的去核率要高.猪卵母细胞IVM在39~44 h内去核率较高,且盲吸法去核效率高于化学诱导去核.     

外源褪黑素对羔羊卵母细胞成熟及卵丘扩展相关基因表达的影响

目的 本研究旨在探究在羔羊卵母细胞体外成熟培养过程中,添加外源褪黑素对羔羊体外受精胚胎发育质量以及卵丘扩展相关基因表达的影响.方法 在成熟培养液中添加不同浓度(0,10,25和50μg/L)的褪黑激素,研究外源褪黑素对羔羊体外受精胚胎卵裂率、囊胚率以及囊胚DNA核碎片化的影响,通过DCFH-DA染色检测卵母细胞中活性氧...     

不同状态的牛供核细胞对核移植胚胎发育的影响

比较了不同状态的牛供核细胞对核移植胚胎发育的影响．结果表明：体外培养2-5,6—10,11—15,16v20代的供核细胞的融合率和卵裂率没有差异,但随着体外培养代数的增加,重构卵发育到囊胚的比例下降．16—20代供核细胞组的囊胚率显著低于2—5和6—10代供核细胞组的囊胚率（分别为19．61％,26．67％和28．57％,P〈0．05）;来源于原代牛（G0）,克隆一代牛（G1）和克隆二代牛（G2）的供核细胞的融合率,卵裂率和囊胚率没有明显差异;对于新鲜供核细胞和冷冻供核细胞,胞质内注射法的重构卵率要明显高于透明带下注射法的重构卵率（分别为81．31％,67．96％和82．08％,52．94％,P〈0．05）,但各组重构卵的卵裂率和囊胚率没有差异,冷冻供核细胞结合胞质内注射法可以获得较好的核移植胚胎发育．