对虾白斑综合症病毒结构蛋白质VP41的研究

VP41蛋白质是对虾白斑综合症病毒的一种结构蛋白,该蛋白质由病毒基因组上的wsv242开放阅读框(ORF)所编码,分子量为41 ku.根据vp41基因的序列,通过PCR扩增获得了该全长基因,将其克隆在载体pET-His上,以E.coli BL21为宿主菌,成功表达并纯化了含His标记的目的蛋白VP41,并制备了特异性鼠抗血清.当纯化的病毒粒子经去污剂处理后,VP41蛋白质被发现完全存在于病毒WSSV囊膜部分,Western blot杂交实验也证实该结果,表明VP41蛋白质是该病毒的一个囊膜蛋白质.通过Far-Western方法还发现VP41具有蛋白聚合作用.     

肠道病毒71型外壳蛋白VP3在Pichia.pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法克隆肠道病毒71型SHZH98株外壳蛋白VP3基因,连接T载体,经序列测定后,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP3,经序列测定证实-factor信号肽和VP3的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导,筛选到5株高效表达VP3蛋白的工程菌株.ELISA实验表明:重组蛋白VP3具有较好的免疫原性.     

O型口蹄疫病毒VP4蛋白一个保守性表位的精细鉴定

口蹄疫病毒(FMDV)的结构蛋白VP4在7个血清型之间是非常保守的,对其抗原表位最小基序的测定有助于开发广谱性多肽疫苗.本研究采用生物合成肽法,利用豚鼠抗FMDV O型标准血清,对最新流行的FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的VP4蛋白进行了线性表位扫描作图研究.结果表明:在覆盖VP4蛋白全长序列的10个18聚肽中,发现1个能与豚鼠抗FMDV O型标准血清发生免疫印迹反应的抗原性肽VP4-3;B细胞表位鉴定确定了抗体识别VP4-3的最小基序是INNYYM;该表位位于VP4蛋白的三维结构表面;对7个FMDV血清型的122个毒株同源蛋白质进行序列比对,发现这一表位在7个FMDV血清型的120个毒株中是100%保守.     

牛Nebovirus VP1蛋白的表达及免疫原性研究

Nebovirus(NeV)是导致犊牛腹泻的重要病原,是国内的新发病毒.VP1是NeV主要结构蛋白,在病毒的感染与免疫中发挥重要作用.以国内NeV流行毒株VP1基因序列为模板,进行密码子偏好性优化、序列合成并插入到pET28a(+)的Nde I和Xho I酶切位点间,构建了表达VP1完整编码框的pET28a-VP1-BL21(DE3)表达载体.SDS-PAGE结果显示,表达的目的蛋白大小约60 kDa,与预期相符;Western-blot结果显示该重组蛋白可以特异地与NeV抗血清反应;家兔免疫试验结果显示该重组蛋白可以刺激兔体产生特异性抗体.本试验成功表达了NeV VP1重组蛋白,具有良好的免疫原性.为进一步研究NeVVP1蛋白的功能和血清学检测方法奠定了基础.     

副溶血弧菌与Hela细胞表面蛋白结合相关外膜蛋白的筛选和鉴定

为了从副溶血弧菌(VP)中筛选出可与宿主细胞表面蛋白互作的外膜蛋白,并研究其与宿主细胞的黏附作用,以Hela细胞株为宿主,将其表面蛋白生物素化后作为靶蛋白,利用层析技术从VP中垂钓到可与之结合的外膜蛋白,对重组蛋白进行质谱鉴定、纯化和Western Blot检测,并采用间接免疫荧光法考察重组蛋白对Hela细胞的黏附能力.从VP中共筛选出5种可与Hela表面蛋白相结合的外膜蛋白,质谱鉴定结果表明:5种蛋白分别为Peptidase、PLP、Omp W、Omp N和Chaperonin,均为胞外蛋白.Omp W、Chaperonin和Peptidase对Hela细胞的黏附作用很强,Omp N的黏附能力次之,PLP的黏附能力最弱.     

小鼠细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析

目的 利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白，并对其免疫原性分析。方法 将优化后的MVM VP2序列克隆至表达载体pFastBac1,命名为pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至DH10Bac感受态大肠杆菌中形成重组杆粒，提取重组杆粒经PCR鉴定正确后转染昆虫细胞Sf9,镜下观察到细胞明显病变后收获重组杆状病毒rBac-MVM VP2。Sf9细胞接重组病毒48和72 h后，用间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证重组蛋白的免疫原性。结果 构建的rBac-MVM VP2重组杆状病毒感染Sf9细胞后，可成功表达MVM VP2重组蛋白，经Western blot和IFA检测分析，重组蛋白具有较好的免疫原性且在病毒感染72 h时表达量较高。经蛋白纯化后可得到纯度较高的VP2重组蛋白。结论 本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达MVM VP2蛋白并具有良好的免疫原性，为VP2相关功能的研究和临床诊断方法的建立奠定基础。     

肠道病毒71型SHZH03株VP1基因在毕赤酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增得到肠道病毒71型(EV71SHZH03)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒VP1/pPIC9K,转化Pichia pastoris 酵母宿主菌Gs115,以Myc-Tag多克隆抗体作为一抗,利用双层滤膜法筛选酵母转化子.甲醇诱导表达.SDS-PAGE分析显示:表达产物的分子量约为30000,与天然VP1大小一致,ELISA实验表明,表达上清液可与EV71患者急性感染期血清呈阳性反应,表明重组蛋白VP1具有免疫原性.     

草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP38的表达分析及多克隆抗体制备

为进一步开展草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP38的生物学功能研究准备实验材料,同时探讨并构建一种草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒的免疫学检测方法。实验构建了VP38的原核表达质粒pET28a-VP38,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG (Isopropylβ?D-Thiogalactoside)诱导表达,8mol/L尿素溶解重组蛋白后免疫小鼠,制备鼠抗VP38多克隆抗体;利用制备的抗体探究Grass carp reovirus-104(GCRV-104)感染后VP38在翻译水平的表达动力学;利用Western blot、间接免疫荧光分析(IFA)对抗体进行评估;构建VP38的真核表达载体pEGFP-N1-VP38,转染至草鱼性腺(Grass carp ovary,GCO)细胞内进行亚细胞定位分析。结果显示:重组VP38蛋白在原核表达系统中以包涵体形式存在;制备的鼠抗VP38多克隆抗体既能够识别重组VP38蛋白,也能够识别GCO细胞感染GCRV-104后表达的VP38蛋白;GCRV-104感染后72hVP38主要分布在细胞质中,与亚细胞定位结果一致;VP38在感染的前期微量表达,感染中后期大量表达。本研究制备的鼠抗VP38多克隆抗体具有较高的效价和较好的特异性,为构建草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒的免疫学检测方法提供了较好的技术路线。     

牛轮状病毒VP4、VP6、VP7基因分子生物学研究进展

轮状病毒是引起幼龄动物急性胃肠炎和腹泻的主要病因.犊牛感染轮转病毒会对集中饲养的牛群造成严重的经济损失,制约养牛产业的发展.轮状病毒的11个节段基因分别编码了6种结构蛋白(VP1-VP4,VP6,VP7)和6种非结构蛋白(NSP1-NSP6),其中VP4和VP7与病毒的毒力密切相关,分别决定了病毒的P型和G型.VP6是病毒的特异性抗原,也是决定轮状病毒分组的重要蛋白.通过综述VP4、VP6、VP7的分子特征及研究进展,对目前开发的疫苗产品进行了简述.     

LvCTL1与WSSV复制的相互关系研究

C型凝集素(CTL)是一类重要的先天性免疫因子,在对虾机体的免疫防御中具有重要的作用.该研究利用相对定量PCR实验检测基因表达量、绝对定量PCR实验检测病毒拷贝数、组织切片分析实验检测感染病毒细胞数.实验数据显示:WSSV感染能显著上调Lv CTL1的表达; WSSV感染的Lv CTL1敲降的凡纳滨对虾中,膜囊蛋白VP28表达量、病毒拷贝数和胃上皮细胞中的感染细胞数都显著高于注射ds EGFP对照组.研究结果表明:WSSV感染后,机体通过上调Lv CTL1表达来抑制WSSV复制.     

对虾白斑综合症病毒结构蛋白质VP24的定位研究

对虾白斑综合症病毒是一种新型的DNA病毒.VP24蛋白质是该病毒粒子的一个主要的结构蛋白质.当纯化的病毒粒子经去污剂处理后,VP24蛋白质被发现完全存在于囊膜部分,Western杂交实验也证实该结果,以上实验结果表明VP24蛋白质是病毒的一个囊膜蛋白质.利用免疫胶体金定位技术对该蛋白质的进一步研究中发现,核衣壳上未见标记的金颗粒,完整的病毒粒子上标记的金颗粒也很少,而囊膜部分破损的病毒粒子上却可观察到大量的金颗粒.我们认为VP24蛋白质是一个囊膜蛋白质,但是它的主体可能存在于病毒的囊膜和核衣壳之间.VP24蛋白质的定位研究将加速阐明病毒感染和包装的机制,并将有助于病毒的诊断和控制.     

A型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因遗传进化分析

对疑似感染FMDV的样本进行了FMDV VP1基因RT-PCR鉴定,测定了其中1个阳性样本序列(命名为HY).采用生物信息学软件比较了HY与参考序列的同源性,并构建VP1基因的分子系统树.结果表明:HY属A型FMDV亚洲拓扑型东南亚-97谱系,与我国近年来报道的A/GDMM/CHA/2013的序列相似性为99.1%,与AF/72疫苗株的相似性仅为79.0%.提示我国近年来报道的A型毒株与AF/72疫苗株的序列差异较大,应及时更换A型口蹄疫疫苗毒株.     

利用搭桥PCR法实现轮状病毒VP7表位片段的重组

选择了RV VP7的3个高度保守可诱发高水平体液免疫反应的中和性抗原表位,人工合成了这3个表位片段。采用了一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组DNA方法-搭桥PCR法,方便快速地构建了轮状病毒VF7蛋白的重组表位基因,将其T／A克隆入PBS-T载体,经过测序与报道序列同源性达100％。结果表明：搭桥法PCR简单易行,快速准确,尤其是在构建2个或多个小基因片段的融合时,比酶切、连接方法更具优越性。     

《儿女英雄传》中“否定词+VP(之前)”的语用分析

"未VP"结构包括"未VP"、"没VP"、"未曾VP"、"不曾VP"等4种表达时间意义的句式。4种句式在《儿女英雄传》中出现的频率各不相同。由"未VP"、"没VP"发展到"未曾VP"、"不曾VP",这是"未VP"结构历史发展的一种选择。4种句式在作品中的用例呈递增趋势。"未VP"句式形成的时代早于"不曾VP"。时代越早,"未VP……先……"的用例越多,而"未VP……早……"的用例则越少。叠合结构"没有VP之前"在《儿女英雄传》中包括5种形式:未VP之前、未VP以前、不曾VP之前、不曾VP以前、没VP以前。叠合结构无论是在形式上还是在数量上都比"未VP时"、"VP时"或"VP之前"等时间格式突出。这与《儿女英雄传》大量使用"未VP"结构表达时间概念的语言习惯有关。表达时间概念的"未VP"结构孕育了叠合结构。     

肠道病毒71型SHZH03株VP2和VP4 基因的进化分析

目的:对SHZH03株、SHZH98株、亚洲流行株(中国台湾98年、日本99年及新加坡2000和2001年流行株等)以及一部分欧洲流行株等的VP2和VP4基因进行了遗传进化分析.方法:在对肠道病毒71型中国(深圳)分离株SHZH03进行全基因组序列测定的基础上,利用DNA-STAR软件对VP2和VP4基因进行遗传进化分析.结果:SHZH03和SHZH98与亚洲流行株中的中国台湾98流行株、日本99流行株的遗传距离较近,而与新加坡2000和2001年流行株的遗传距离较远;SHZH03株与一些欧洲流行株有较大的差异.结论:中国深圳地区流行的肠道病毒71型有可能来源于中国台湾1998年EV71大规模流行时的毒株.     

猪脑心肌炎病毒VR-129 B株VP2重组蛋白的构建表达及其免疫活性分析

为获得大量猪脑心肌炎VP2基因及蛋白研究的细胞模型,构建pDC315-EMCV-VP2真核表达载体,且将其转染到293T细胞,筛选出阳性质粒进行克隆。EMCV VR-129B株VP2基因序列参照GenBank(登录号:X74312),利用RT—PCR方法扩增VP2的全基因序列,将其与质粒pDC315经NheI和XhoI双酶切后连接,构建pDC315-EMCV-VP2重组表达质粒,并将其转染至293T细胞。使用荧光定量PCR方法观察pDC315-EMCV-VP2真核表达载体在细胞中的表达情况。双酶切PCR结果获得大小为780 bp的基因片段,测序结果显示与GenBank上已经公布的同名基因(登录号:X74312)序列片段同源性为100%,重组质粒构建成功。实时荧光定量PCR(QPCR)结果显示,重组质粒转染组与空质粒组之间相比,EMCV-VP2基因的表达量显著上调(P0.001);在荧光显微镜下观察转染细胞,转染成功部分出现较亮绿色荧光,EMCV-VP2基因表达稳定。从转染细胞中提取重组蛋白与EMCV阳性血清和阴性血清进行ELisa反应,具有较好免疫活性。