人白介素-2重组基因的T载体和pET28a表达载体的构建

从人单核细胞中提取总RNA,利用RT－PCR方法构建cDNA—mRNA杂交链,然后用人白介素－2基因的特异引物进行PCR,PCR产物回收后与T载体连接,经过转化、质粒酶切、测序等一系列手段对插入情况和序列是否正确进行鉴定．鉴定正确后用另一组带有酶切位点的引物和pfu酶进行PCR,用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切PCR回收片段及pET28a表达载体,二者经过连接、转化、质粒酶切、测序等手段重新鉴定序列是否正确．结果表明,插入列T载体和pET28a载体中的序列为402 bp的不带信号肽的基因片段,此序列和GenBank中公布的IL-2序列相一致,故从人单核细胞中提取mRNA后,利用RT-PCR构建的人IL-2基因序列完全正确,为下一步的工作提供了基础。     

牛酪蛋白cDNA基因克隆的改建

牛酪蛋白全长cDNA克隆pB_aS_1C184经Bgl Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,回收其中的酪蛋白基因编码片段,与经BamH Ⅰ、SmaⅠ双酶切的植物表达载体pBI121.2分两步连接:第一步载体的BamHⅠ末端与酪蛋白基因的BglⅠ粘性末端连接;第二步用T_4DNA多聚酶补平酪蛋白基因的EcoR Ⅰ末端,再与载体SmaⅠ进行平末端连接而环化,转化JM109菌株,从得到的33个转化子中,通过~(32)P标记的酪蛋白cDNA基因为探针,点杂交筛选到一个阳性克隆。经酶切鉴定,确认酪蛋白cDNA基因编码区已正确插入到pBI121.2中。     

IL-2和EGFP共表达逆转录病毒载体的构建

设计质粒pR evT et-O n和pIRES2-EGFP的接头序列,经一系列酶切连接,重组为含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和多克隆位点(M CS)的逆转录病毒载体pR evIRES2-EGFP;同时将质粒pBV 220-IL-2和pEGFP-C 1重组为含有人白细胞介素-2(h IL-2)的过渡质粒pEGFP-C 1-IL-2.再酶切质粒pEGFP-C 1-IL-2,琼脂糖凝胶电泳回收IL-2基因片段,并将其连接到pR evIRES2-EGFP的多克隆位点中,转化E.coli DH 5α进行扩增,提取质粒DNA获得重组体pR evIRES2-EGFP-IL-2.鉴定结果表明构建的逆转录病毒表达载体pR evIRES2-EGFP-IL-2完全正确.     

抗冻肽基因在植物表达载体中的构建

植物表达载体P^Bin438经HindⅡ和EcoPⅠ双酶切,回收其HindⅡ－BmaHⅠ-Sal-EcoRⅠ片段和P^UC19HⅢ-EcoRI片段连接,构建成载体记为P^UC38。将含AFP基因的克隆经BamHI,XhoⅠ双酶切,得到的BamHI-AFP-XhoⅠ片段装入P^UC38BanHI-SalⅠ位点,克隆AFP基因。然后再用HindⅢ、EoR1双酶切AFP基因,插入P^Uin438的HindⅢ-EcoRⅠ位点,进而构建成带有AFP基因的植物表达载体,为进一步研究AFP基因在植物中表达奠定了基础。     

人溶血磷脂酸受体2基因的克隆及其在293T细胞中表达

在以前的研究中我们发现溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)通过溶血磷脂酸受体2(Lysophosphatidic acid receptor 2,LPAR2)介导促进胃癌细胞迁移.为进一步研究LPAR2介导的信号转导机制与功能,本研究试图建立过表达的LPAR2转基因细胞模型.选用人胃癌SGC-7901细胞系的cDNA经RT-PCR法克隆得到LPAR2基因CDS区,并亚克隆到pMD19-T载体,通过测序确认后、经酶切、连接到表达载体pIRES2-EGFP,酶切和测序鉴定获得pIRES2-EGFP-LPAR2重组质粒;通过LipofectamineTM2000介导把表达载体质粒转染进293T细胞.Western Blot法检测结果说明人LPAR2蛋白在293T细胞中得到表达.     

牛酪蛋白cDNA基因克隆的改建

牛酪蛋白全长ｃＤＮＡ克隆ｐＢａＳ１ｃ１８４Ｘ ＧＬⅢ和ＣＯｒＩ双酶切，回收基中的酪蛋白基因编码片段，与经ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ双酶切的植物表达载体ｐＢＩ１２．１２分两步连接；第一步载体的ＢａｍＨＩ末端与酪蛋白基因的ＢｇｌⅡ粘性末端连接；第二步用Ｔ４ＤＮＡ多聚酶补平酪蛋白基因的ＥｃｏＴＲⅠ末端，再与载体ＳｍａⅠ进行平末端连接而环化。     

青鱼线粒体DNA限制性酶切图谱的研究

用10种限制性内切酶对青鱼(Mylopharyngodonpiceus)的肝脏mtDNA进行了分析,其分子质量为9 949×106u,分子大小约为16 60kb.PstⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、XbaⅠ、BglⅡ、BglⅠ在青鱼的mtDNA分子上分别具有0、3、1、4、4、3、2、2、2、3个切点.根据单酶解及双酶解结果建立了青鱼mtDNA的限制性酶切图谱.     

极端嗜热厌氧纤维素分解菌基因文库的构建及其内切葡聚糖酶基因片段的克隆

以从云南邦拿掌温泉中分离、纯化的高温厌氧纤维素分解菌邦2菌(Cadicellulosiruptor)为材料,制备其总DNA,经限制性核酸内切酶EcoRⅠ部分酶切后,在T4DNA连接酶的作用下与经EcoRⅠ完全酶切、去磷酸化的质粒载体pUC18连接,然后转化E.coliJM109,建立了邦2的基因文库,经筛选鉴定得到6.3×103个重组子;重组子经刚果红平板验证:约有23.5%菌落呈现透明圈;重组子经EcoRⅠ酶切验证显示:重组质粒均含有外源DNA插入片段.结果表明已克隆到邦2菌纤维素酶系中的内切葡聚糖酶基因(ED基因)片段.     

类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大...     

黑木相思双低频酶cDNA-AFLP反应体系的建立

以黑木相思组培苗为实验材料,对影响cDNA-AFLP反应体系的关键因素进行了研究,建立了适用于黑木相思的cDNA-AFLP分析体系.结果表明:适用于黑木相思dscDNA的限制性酶切组合为EcoR Ⅰ和PstⅠ,dscDNA酶切用量为500 ng.用作预扩增模板的连接产物稀释倍数为1倍,用作选择性扩增模板的预扩增产物稀释倍数为50倍.     

谷子乙酰辅酶A羧化酶BC功能域的克隆及原核表达载体的构建

根据已知的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)序列设计合成了1对引物,对ACCase基因的BC功能域进行扩增,所得产物与预期片段大小一致,约1.8kb。该片段与克隆载体PGEM TEase连接,转入感受态大肠杆菌DH5а中增殖。提取质粒进行PCR鉴定,将阳性克隆与原核表达载体PQE30分别用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后回收目的片段进行连接,并转入感受态大肠杆菌M15中,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)fAFLP方法的建立

以大黄鱼为材料,探索及优化了影响荧光标记AFLP(fAFLP)分析体系的主要因素.结果表明:内切酶EcoRⅠ与MseⅠ各0.35 U,双酶切350 ng大黄鱼基因组DNA,依次反应4 h可得最佳效果;T4DNA连接酶2.5 U,16℃过夜连接3μL酶切产物与接头时效果最佳;以1μL连接产物作底物,EcoRⅠ与MseⅠ预扩引物分别为0.3μmol/L与1.5μmol/L时预扩效果最佳;预扩产物稀释超过100倍作为选择性扩增的模板时致使某些样品的电泳条带缺失.使用该体系分析了一个野生大黄鱼群体的AFLP片段的多态水平,结果证明该方法简便有效,可用于群体遗传多态性分析.     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

Egr-1基因反义干扰表达载体的构建与鉴定

为构建可在人肝癌细胞中稳定表达Egr-1基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,设计合成Egr-1基因shRNA片段,连接到经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pGreenPuro~(TM)shRNA真核表达载体中,连接产物转化大肠杆菌后挑取阳性菌落扩大培养,经菌液PCR法初步鉴定为pGreenPuro-Egr-1shRNA重组子的重组子DNA,用测序法进一步鉴定,结果显示成功构建了Egr-1基因shRNA的反义干扰表达载体pGreenPuro-Egr-1shRNA.     

重要海水养殖鱼斜带髭鲷和花尾胡椒鲷16S rRNA遗传变异研究

应用PCR技术扩增了我国南方重要养殖石鲈科鱼类斜带髭鲷(Hapalogenys nitens)和花尾胡椒鲷(Plectorhinchus cinctus)线粒体DNA(mtDNA)的16S rRNA基因片段,纯化后分别进行EcoRⅠ、MseⅠ、PstⅠ、SacⅠ和HindⅢ等5种限制性内切酶酶切和测序分析.酶切结果为:斜带髭鲷16S rRNA扩增片段被MseⅠ和SacⅠ两种内切酶酶切,花尾胡椒鲷16S rRNA扩增片段只被MseⅠ酶切.两者在MseⅠ和SacⅠ酶切图谱的差异可作为区分两者的遗传标记.16S rRNA序列分析结果表明,斜带髭鲷和花尾胡椒鲷的遗传相似度为86.94 %,遗传差异为13.06 %.进化上,两者分化年代大约为1.98×106年前.     

坛紫菜(Porphyra haitanensis)叶绿体DNA 的快速提取

以阴干的坛紫菜叶状体为材料，通过酶解等方法获取完整的叶绿体．再裂解叶绿体并酚仿抽提获得叶绿体DNA．限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切及RAPD检测结果显示：叶绿体DNA与基因组DNA的酶切图谱及RAPD图谱均有比较明显的差异．多次重复实验证明，按此法提取的叶绿体DNA．其得率稳定，并可用作PCR扩增的模板及酶切图谱的构建等．该方法操作简便．过程快捷．可作为大型海藻叶绿体DNA提取的参考方法．     

鳗鲡病原菌二联外膜蛋白基因工程表达载体的构建

根据鳗鲡病原性嗜水气单胞菌Ⅱ型孔蛋白(porinⅡ)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白S(ompS2)的基因全长序列,分别选取这两个全长序列中表达其蛋白质膜外部分且理论免疫原性较好的两个基因片段,通过融合PCR技术连接这两个外膜蛋白基因片段.根据表达载体(pGEX-2T-His)的限制性酶切位点在连接序列片段的两端引入限制性酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ,成功构建了双外膜蛋白基因片段重组表达载体(pGEX-2T-His-porinⅡ-ompS2).表达载体理论表达产物的蛋白质结构预测表明表达产物无信号肽和跨膜区,不存在三级结构;亲水性和免疫原性预测分析表明该表达蛋白理论上为可溶性蛋白并具有丰富的抗原决定簇,本研究为该表达载体的蛋白表达、纯化以及表达产物的免疫原性研究奠定了基础.