白藜芦醇对镉诱导HEK 293T细胞自噬与凋亡的影响

为了探究白藜芦醇与镉诱导人胚胎肾细胞293(HEK 293T)细胞自噬与凋亡之间的关系,本研究在已证明低浓度镉诱导细胞自噬,高浓度镉导致细胞凋亡的基础上,以HEK 293T细胞为研究对象,并分别与镉、白藜芦醇及各种抑制剂进行联合培养,利用免疫印记分析检测自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、溶酶体标志蛋白cathepsin L...     

稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建

为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.     

磷酸钙法将MMP-2，MMP-3双基因干扰载体转入HEK293T细胞的效率观察

检测用磷酸钙法能否将修饰后用于沉默MMP-2,MMP-3基因的慢病毒载体有效地转入到HEK293T细胞。利用磷酸钙法,MMP-2,MMP-3双基因干扰载体（MMP组）与对照质粒（对照组）被分别转染HEK293T细胞,在转染后的第24,48及72h,通过计算绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞数的百分比来判断转染效率。转染24h后,两组细胞均生长状况良好,荧光显微镜下观察,已有大量绿色荧光出现,计算MMP组转染效率为（91．5±6．2）％,对照组转染效率为（80．3±4．7）％;转染后48—72h,两组感染效率均未见明显下降。与对照相比,插入了MMP-2,MMP-3 shRNA模板序列的慢病毒载体没有降低磷酸钙法转染HEK293T细胞效率,反而有所增高。     

脑心肌炎病毒pCMV-HA-VP2表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus,EMCV)衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2,并在HEK293细胞中表达.方法:提取EMCV的总RNA,RT-PCR扩增VP2基因,酶切后构建带HA标签的真核表达质粒pCMV-HA-VP2,运用脂质体介导法将其转染至HEK293细胞中,分别进行过表达检测、Westernblotting分析及IFA检测来验证VP2基因的转录及表达情况.结果:重组表达载体pCMV-HA-VP2构建成功,转染至HEK293细胞中,VP2蛋白和HA标签融合表达成功.结论:EMCV衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2在HEK293细胞中的成功表达,为EMCV衣壳蛋白的功能研究提供理想的实验材料,同时也为EMCV感染机制及其受体研究奠定基础.     

白介素12诱导T细胞凋亡的作用

目的：探讨白介素12（IL-12）对T细胞凋亡的作用。方法：用dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Annexin V的方法测定IL-12诱导后T细胞凋亡率。结果：IL-12诱导人的白血病T细胞株TIB-152和人的淋巴瘤T细胞株HTB-176的凋亡。以50ng/mL的质量浓度作用效果最佳,作用时间在3和6d内达到最高峰。结论：IL-12能诱导T细胞的凋亡,其诱导作用从细胞早期质膜的改变开始,并与IL-12的浓度和T细胞成熟状态及作用时间有关。     

新型PCV2衣壳融合蛋白在HEK293F细胞瞬时表达研究

猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type 2,PCV2）衣壳（Capsid）蛋白是制备抗猪圆环2型病毒亚单位疫苗的有效免疫抗原,能在大肠杆菌及杆状病毒/昆虫细胞表达系统中获得表达,然而在哺乳细胞中的表达研究仍然缺乏。瞬时表达条件考察结果显示,采用宿主HEK293F细胞及PEI-40kDa转染试剂能获得35%病毒PCV2 Capsid基因细胞转染效率。转染试剂PEI(Polyethylenimine)与DNA比例差异会影响复合物形成大小及形态,复合物形成15～80 nm颗粒有利于转染效率的提高。实验以免疫逃逸型猪圆环病毒2b型NDSU41513病毒株,设计了新型PCV2 Capsid (△1-41aa)-Fc(pig) protein(PCFP)分子。在3 L反应器中成功实现了HEK293F细胞瞬时表达PCFP,表达水平达到3.8 mg/L。PCFP蛋白能够自主装形成约为41 nm类病毒颗粒,诱导小鼠机体内产生强烈的体液免疫反应,具有很高的应用潜力。     

荔枝核提取物对HepG-2细胞生长抑制及凋亡诱导机制的探讨

目的:探讨荔枝核提取物成分L2.3对人肝癌细胞HepG-2的生长抑制作用及其分子机制.方法:MTT法测定样品对HepG-2细胞的增殖抑制,荧光染色观察细胞凋亡;比色法检测样品对HepG-2中caspase-3、caspase-8和caspase-9活性的影响,流式细胞仪检测并分析Fas蛋白表达的变化.结果:L2.3对HepG-2细胞表现出时间及剂量依赖性增殖抑制活性(P<0.05),其半数抑制质量浓度为43.0 μg/mL;处理组细胞中出现致密浓染亮蓝色凋亡小体.较高质量浓度的L2.3处理细胞后,caspase-3、8、9的活性均呈时间依赖性增高(P<0.01),且Fas蛋白的表达也明显上调(P<0.05).结论:荔枝核提取物L2.3对HepG-2细胞有体外增殖抑制活性,并介导 caspase-3、caspase-8、caspase-9活性改变及Fas蛋白表达的上调,以此诱导细胞凋亡的发生.     

甘蓝型油菜基因BnRCH转染人HEK293A和Hela细胞的研究

本研究从植物基因在动物细胞异源表达的角度入手,采用外源基因稳定转染的方法,向人胚胎肾细胞HEK 293A和人宫颈癌细胞Hela导入了BnRCH基因,获得了HEK 293A和Hela细胞的稳定转染子.使用RTPCR、qPCR和Western blot等方法鉴定了获得的稳定转染子,确认了稳定转染子的成功建立.本研究一方面说明BnRCH虽然为植物基因,却仍然能够在动物细胞中正常表达;另一方面也为开展对BnRCH基因在动物细胞中的功能研究和应用开发建立了平台.同时,使用免疫细胞化学法和绿色荧光蛋白质     

葡萄籽提取物诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡的实验研究

该文研究葡萄籽提取物(GSE)对前列腺癌PC-3细胞的生长抑制及凋亡作用,分析GSE诱导PC-3细胞凋亡的途径.采用四唑盐(MTT)比色法测定GSE对PC-3细胞的毒性作用;利用倒置显微镜、透射电镜观察GSE对PC-3细胞引起的形态学改变;碘化丙啶(PI)、吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)双染法观察GSE诱导PC-3细胞凋亡的作用;Western blot探索细胞凋亡途径.结果表明,MTT法测定GSE能显著抑制PC-3细胞生长.倒置显微镜、透射电镜下可见细胞形态改变.PI染色显示,GSE将PC-3细胞周期阻滞在G0/G1期;GSE诱导PC-3细胞凋亡,AO/EB染色,荧光显微镜下可明显看到凋亡细胞、死亡细胞.Western blot显示GSE通过caspase途径诱导细胞凋亡.从细胞和亚细胞水平研究证实了GSE对人雄激素非依赖性PCaPC-3细胞具有毒性作用,GSE可通过线粒体途径诱导PC-3细胞凋亡和坏死,抑制细胞生长.     

毛郁金乙醇提取物降血脂作用研究

【目的】研究毛郁金(Curcuma aromatica)乙醇提取物降血脂作用,为其综合开发利用提供依据。【方法】通过高脂饲料喂养及脂肪乳剂灌胃,建立高脂血症大鼠模型,连续3周给予毛郁金乙醇提取物进行治疗,设正常组、高脂模型组、辛伐他汀组和毛郁金乙醇提取物高、中、低剂量(生药18g·kg-1·d-1,12g·kg-1·d-1,6g·kg-1·d-1)组,以动物实验研究毛郁金乙醇提取物降血脂的作用。【结果】毛郁金乙醇提取物可降低大鼠血清总胆固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)的含量,并提高血清高密度脂蛋白(HDL-C)含量,对血清CHOL、LDL-C的降低作用:高中低剂量组,中剂量组对降低TG、升高HDL-C含量具有较好作用,毛郁金各给药组均对大鼠血清LDL-C含量有极显著降低作用。【结论】毛郁金乙醇提取物具有明显的降血脂作用。     

透明质酸合成酶2真核表达载体的构建及表达

构建了透明质酸合成酶2真核表达载体,并观察其在真核细胞中的表达。利用RT-PCR法从MG63细胞总RNA中扩增,获得人透明质酸合成酶2cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-N3,将经双酶切鉴定和DNA测序证实的阳性重组子命名为pEGFP-N3-HAS2。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。双酶切鉴定和DNA测序证实成功构建pEGFP-N3-HAS2真核表达载体。转染HEK293细胞后可见HAS2-EGFP融合蛋白高表达并定位于浆膜。该载体的成功构建为进一步探讨透明质酸合成酶2在治疗骨性关节炎、修复关节软骨缺损中的应用价值奠定了基础。     

双酚类化合物对人胚肾细胞HEK293的毒性和氧化应激的研究

双酚类化合物(bisphenols, BPs)是一类新型环境有机污染物,BPs排放到环境介质后经多种途径进入生物体并在体内蓄积,已逐渐成为威胁环境和健康的重要风险因子。为探明BPs对人体健康的潜在毒性效应,本研究选取人胚肾细胞HEK293作为模型,通过测定细胞活力、胞内活性氧含量、氧化应激参数(SOD、GSH、MDA)及细胞内钙离子水平,比较了BPA、BPS、BPF和BPAF对HEK293细胞的毒性影响。结果表明,BPA、BPS、BPF和BPAF能够不同程度的抑制HEK293细胞活力,通过促进氧化应激产生 ROS,降低抗氧化能力,迅速提高细胞内Ca²⁺水平,诱导HEK293细胞损伤。在本研究所选的浓度范围内,BPAF对HEK293细胞的毒性影响最大,BPA和BPF对HEK293细胞的毒性影响次之,BPS对HEK293细胞的毒性影响较小。本研究为深化了解双酚类化合物的毒理学系统研究和风险评估提供参考依据。     

南瓜醇提物对DNA损伤的保护及体外抗氧化研究

采用琼脂糖凝胶电泳技术,检测南瓜醇提物(ethanol extract from pumpkin,EEP)对因紫外线照射过氧化氢(H2O2)产生羟自由基(·OH)而引发质粒pUCl8 DNA链断裂的保护作用.用化学体系模拟法测定EEP对1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)和·OH的清除能力;将Fe3 还原成Fe2 的能力以及在β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系中的总抗氧化能力.结果表明,EEP在浓度为12.0 mg/mL时能有效保护DNA的氧化损伤,对DPPH·和·OH的清除能力较强,IC50值分别为18.8 mg/mL和44.9 μg/mL时有显著的还原力和总抗氧化力.EEP具有较强的体外抗氧化活性.     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。经酶切和基因测序鉴定LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达。说明基因重组技术可成功构建LMP3／pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内。