cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草. Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm)基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高. 以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

病毒诱导的烟草DHS基因的沉默

将本生烟草(Nicotiana benthamiana) DHS (deoxyhypusine synthase, 脱氧羟腐胺赖氨酸合酶)基因的cDNA片段插入到马铃薯X组病毒(PVX)载体中, 构建重组病毒载体PVX-NbDHS. 通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统, 抑制本生烟草DHS基因表达. 感染植株表现为生长增强、叶片叶绿素含量下降、叶片衰老延缓和开花推迟. 半定量RT-PCR和Northern blot结果表明, PVX-NbDHS-VIGS植株中DHS mRNA丰度显著下降. Western blot检测表明, DHS靶蛋白eIF-5A的表达量与DHS呈平行下调变化. 综合分析植物表型和相应基因表达水平, 可以推断DHS在植物生长与发育中起重要作用.     

棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

采用功能筛选策略从以PVX病毒载体建立的棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae) cDNA文库中克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段). 以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA文库, 采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana), 从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆. 对上述阳性克隆进行序列测定和分析, 结果显示, 其中7个与已知的基因具有较高的同源性, 其中PBC43编码一个特异的elicitin蛋白; PBC163编码一个Rab蛋白, 与大豆疫霉的RAB同源性较高; PBC241编码抗增殖蛋白(prohibitin); PBN62编码一个热激蛋白60 (HSP60). 还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因, 提示可能是该病原菌特异的激发子基因. 上述结果表明, 利用病毒表达载体构建cDNA文库, 用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生过敏反应的激发子基因, 该方法可望为其他植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台.     

卫星DNA沉默载体的改良及其改变矮牵牛叶色和花色的研究

利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)机制可以从基因组序列入手来进行植物基因功能研究, 这是一种反向遗传学方法. 本室曾成功利用中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)的卫星DNA构建了基因沉默的载体. 本研究对该载体进行了改良, 在本氏烟上对Su基因的沉默测试表明, 改良后的载体与原载体诱导沉默的效率没有差别, 但是改良后的载体构建沉默克隆的过程得以简化. 进一步用改良后的沉默载体分别抑制矮牵牛内源基因Su和CHS基因的表达. 含Su基因的沉默载体接种矮牵牛大约2周后, 矮牵牛沿叶脉开始黄化; 含CHS基因的沉默载体接种矮牵牛约1个月后, 新开的牵牛花上出现花色的褪变, 并由单色花变成了杂色花.     

cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草.Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高.以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

中国番茄黄化曲叶病毒和烟草曲茎病毒AC2和AC4蛋白为RNA沉默的抑制子

中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物（TYLCCNV-Y10）能系统侵染本氏烟（Nicotiana benthamiana）等寄主植物但不诱导明显的症状，而烟草曲茎病毒Y35分离物（TbCSV-Y35）单独侵染则诱导曲叶等症状。对表达GFP基因的转基因本氏烟的接种试验表明，TYLCCNV-Y10不回复已建立的GFP沉默也不抑制GFP沉默的建立，而TbCSV-Y35能部分回复已建立的沉默且能在新叶抑制沉默的建立。农杆菌共浸润试验发现，TYLCCNV-Y10和TbCSV-Y35的AC2和AC4蛋白都能抑制GFP的局部沉默并延迟GFP的系统沉默，为RNA沉默的抑制子。比较共浸润区GFP mRNA的积累表明，Y10 AC2与Y 35AC2蛋白具有相近的RNA沉默抑制能力，而Y35 AC4蛋白是一个比Y10 AC4蛋白更强的抑制子。因而，TbCSV-Y35和TYLCCNV-Y10致病性差异的原因可能与二者AC4蛋白的功能差异有关。     

基因转录后沉默信号可以在拟南芥嫁接体内快速双向传递

RNA干扰(RNAi)是引起生物体基因转录后沉默的新技术之一, 通过转基因向植物体内引入特异的RNA沉默信号, 已成功用于基因功能研究. 我们利用拟南芥动蛋白异型体KatB和KatC两个基因上共有的一段同源编码序列(168 bp)构建了能导致目标基因KatB和KatC双基因转录后沉默的DEX (dexamethazone) 诱导性RNAi载体. RT-PCR和Northern blot结果显示, 转基因拟南芥纯合体植株(简称RNAi型植株)经DEX诱导后,KatB和KatC的mRNA逐渐减少, 表明这两个基因发生了转录后沉默作用. 用改进后的简易方法将RNAi型与野生型拟南芥植株进行高效率嫁接, 对砧木和接穗中目标基因mRNA变化进行了半定量RT-PCR检测. 结果表明, 无论用RNAi型植株作为砧木或接穗, DEX诱导产生的基因沉默信号均能导致相应野生型接穗或砧木中KatB和KatC mRNA的减少, 证明说明基因转录后沉默信号可以通过嫁接面在拟南芥体内双向传递; 与已报道的基因沉默信号在烟草嫁接体内传递速度相比, 拟南芥基因沉默信号的传递更为迅速．     

利用病毒诱导的基因沉默技术研究一个豌豆PI同源基因的功能

在植物发育生物学研究中, 对很多非模式植物基因功能的研究总是因为缺乏快速有效的方法而受到限制. 病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术是近年来发展起来的一种反向遗传学快速研究基因功能的方法. 本研究利用一种基于PEBV (pea early browning virus)的VIGS体系研究了豌豆PsPI基因的功能. 豌豆在其PsPI基因沉默后出现了类似于拟南芥pi突变体/金鱼草glo突变体的表型, 导致花瓣向萼片以及雄蕊向心皮转变. 半定量RT-PCR分析发现, 在VIGS-PsPI沉默植株花苞中, PsPI基因的mRNA水平显著下降. mRNA原位杂交结果显示, PsPI基因早期在起始共同原基的部位表达, 后期在花器官第二、三轮表达. 本研究结果证明了PsPI基因具有拟南芥PI/金鱼草GLO同源基因的功能, 说明这类基因在进化和功能上是相当保守的, 同时也表明VIGS是一种研究植物基因功能的快速有效的方法, 特别是对于那些转化困难的非模式植物基因功能的研究具有更为重要的意义.     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

水稻瘤矮病毒基因组第11片段编码一个RNA沉默抑制子

水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)是中国及东南亚国家水稻上的一个重要病原, 但有关RGDV与植物细胞互作的分子机制仍不清楚. 本研究利用农杆菌共渗透的方法鉴定了RGDV基因组S11片段编码蛋白Pns11在转GFP (green fluorescent protein)基因本生烟纯合系(Nicotiana benthamiana line 16c)中的抑制子活性. 在该系统中, Pns11 能抑制由GFP正义RNA介导的局部和系统沉默, 并能灭活RNA沉默信号或阻断沉默信号的移动. 体外表达Pns11能增强马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)在本生烟上的致病性. 该抑制子在局部和系统沉默抑制实验中能降低siRNA 的累积, 但不能完全消除其存在. 结果表明, Pns11干扰了RNA沉默途径的起始阶段.     

表达Cryptogein基因的烟草抗病性和耐盐性增强

隐地蛋白(cryptogein, Crypt)是由隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)分泌的一种分子量约为10 kD的蛋白类激发子. 用农杆菌介导的叶盘转化法获转Crypt (PAL::Crypt)和CryK13V (CaMV35S::CryK13V)基因的烟草植株. 接种试验结果表明, T₂代转基因烟草株系对黑胫病菌(Phytophthora parasitica var nicotiana, Ppn)、赤星病菌(Alternaria alternata)和野火病菌(Pseudomonas syringae pv tabaci)的抗性显著增强. Northern杂交和RT-PCR分析结果表明, 低水平的表达转化基因Crypt和CryK13V就足以激活PR-1a和PR-5等防卫反应相关基因的表达; 在PAL::Crypt转化系统中, 病原菌Ppn能快速和高水平诱导PR-1a等病程相关基因的表达, 表明诱导型PAL启动子对入侵病原菌能及时识别并快速、有效地激活防卫反应, 从而赋予转基因植株抵抗病原菌侵染的能力. 研究还发现, 表达Crypt和CryK13V基因的烟草植株耐盐性比对照明显提高, 转化株系中高水平组成型表达PR基因和转录因子可能与耐盐性增强有一定正相关性. 上述结果表明, 植物对生物和非生物逆境的抗性途径和机制存在着交叉.     

一个竹类植物MADS盒基因的克隆及其在拟南芥中的表达

采用RACE方法, 从竹类植物麻竹(Dendrocalamus latiflorus)幼穗中克隆到一个含完整编码区及3′端非翻译区的cDNA, 命名为 DlMADS18. 该cDNA全长1039 bp; 编码区共编码249个氨基酸, 具有典型的植物MADS盒基因结构, 由MADS区、I区、K区和C末端组成. 序列相似性分析结果表明, DlMADS18属于AGL6亚家族, 其氨基酸序列与水稻(Oryza sativa L)的MADS盒基因OsMADS6同源性最高, 序列一致性为88%, 与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AGL6一致性为59%. 将DlMADS18置于CaMV 35S启动子控制下在拟南芥中异位表达, 转基因拟南芥表现出叶卷曲、植株矮小、开花时间提前、花聚生于花序顶端等性状, 表明DlMADS18很可能参与麻竹开花时间的调控.     

利用人工控制细胞死亡策略培育抗稻瘟病水稻

利用细菌编码RNase的barnase 基因及其特异抑制剂编码基因barstar构成的双元组分系统, 把本实验室构建的具有稻瘟菌(Magnaporthe grisea)诱导活性的嵌合启动子与barnase基因融合, 再与由CaMV 35S启动子驱动的barstar的构件融合, 构建植物表达载体pWBNBS和pPBNBS, 转化水稻, 并对转基因水稻进行了抗稻瘟病和白叶枯病的检测. 结果表明, 接种稻瘟菌后, 转基因水稻植株中barnase基因受诱导表达; 在稻瘟菌侵染诱导下, barnase的表达超过barstar的抑制, 导致转基因水稻叶片出现类似过敏感应, 表现出对稻瘟病的抗性; 转基因水稻对白叶枯病表现出一定的抗性. 这些结果说明, 通过该双元组分系统策略获得的转基因水稻具有明显的抗致病性真菌和一定程度的抗细菌危害的较广谱抗性.     

大蒜金属硫蛋白家族新成员AsMT2b在镉离子胁迫下的功能分析

利用RACE方法, 从大蒜(Allium sativum)幼苗中克隆到一个MT基因家族的新成员, 命名为AsMT2b. AsMT2b全长520 bp, 编码80个氨基酸, 具有type 2 MT蛋白的结构特征, 但其Cys的位置和排列方式与其他type 2 MT蛋白具有明显差异. RT-PCR结果表明, 该基因与其他 type 2 MT的表达模式不同, 只有在CdCl₂的胁迫强度增加到一定程度时才增强表达. 将AsMT2b在酵母细胞中表达后可以提高转化子对Cd的抗性. 同时AsMT2b在拟南芥中过表达后, 转基因植株对Cd抗性显著增强, 同时Cd的积累量也增加. AsMT2b在镉离子胁迫下的特性表明, 其在Cd污染土壤的植物修复中具有应用前景.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

鸡传染性支气管炎冠状病毒北京分离株全基因组序列的测定及其特征分析

鸟类传染性支气管炎病毒(AIBV)属于冠病毒科, 冠状病毒属, 是单股线状、正链RNA病毒, 基因组全长近28 kb, 具有3′多聚A尾和5′帽子结构的特征. 采用PCR产物克隆测序和引物步移(primer walking)直接测序结合的方法, 完成了IBV北京分离株的全基因组序列的测定. 该毒株基因组序列全长为27733 bp, 生物信息学分析表明, 它具有10个明显的可读框(ORF); 通过基因定位后其基因排序为: 5′-orf1a-orf1ab-s-3a-3b-e-m-6a-6b-n-3′. 对IBV北京分离株的全基因组序列, 与报道的IBV及造成人类严重急性呼吸综合征(SARS)的病毒(SARS-CoV)进行了比较分析. 结果表明, AIBV是一种变异较大的病毒, 其全基因组序列与国外公布的AIBV全基因组序列相似性仅有85.2%, 与国内报道的不完整AIBV序列比较, 相似性也只有91.2%; 而与SARS病毒基因组全序列比较, 相似性仅为50.8%, 说明它与SARS-CoV关系不大. 同时, 还使用clustalw 1.81 和 Treeview软件构建了冠状病毒的全序列、S蛋白、M蛋白和N蛋白的系统发生树, 结果表明, 鸡IBV北京分离株是第3组病毒的惟一成员, 它与SARS-CoV存在很大的遗传距离. 这项研究将对我国鸡传染性支气管炎病原的鉴定和疾病的控制起到重要的作用.     

杆状病毒P49蛋白的Caspase切割位点的鉴定

海灰翅夜蛾核型多角体病毒(SlNPV)的p49基因, 可抑制病毒感染引起的昆虫细胞Sf 9的凋亡. 用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达的P49蛋白可抑制Caspase的活性. 通过氨基酸序列测定发现, P49蛋白的91 ~ 95位的氨基酸序列是⁹¹TVTDG⁹⁵. P49蛋白在体外可被人及家蚕Caspase切割, 切割后均产生约10和40 kD的2个片段. 经定点诱变得到的P49蛋白94位氨基酸突变体不能被人及家蚕Caspase切割, 同时也失去对Caspase的抑制功能. 而91位突变体蛋白仍可被Caspase切割, 并保留了对Caspase 抑制的部分活性. P49蛋白不仅作用于下游的效应Caspase, 也可作用于上游的启始Caspase, 它是一个广谱的Caspase抑制剂.     

SARS-CoV编码蛋白质的识别

选取非典型肺炎病毒(SARS-CoV, NC 004718)和其他6种冠状病毒共计100个编码蛋白为样本, 从172个变量中经逐步回归选取23个变量建立多元线性回归模型, 模型的复相关系数R² = 0.645, 交互检验R²_cv = 0.375. 剔除4个异常样本后, 模型的复相关系数R² = 0.743, 交互检验R²_cv = 0.543.     

水稻赤霉素20-氧化酶基因(rga5)的正、反义转化对水稻生物学性状的影响

通过PCR方法从水稻“矮子占”和“南特号”的基因组DNA中分离出赤霉素20-氧化酶基因(rga5, 其编码区含1119 bp. 其编码蛋白与已报道的水稻赤霉素20-氧化酶基因OsGA20ox相比有11个氨基酸不同, 其中9个氨基酸为移码差异. 通过基因枪法将该基因的正、反义表达质粒pSrga5和pArga5转化水稻“中花8号”, 获得了生物学性状有明显变异的转基因植株. 正义转化表现出植株增高、叶片和穗变长、穗粒数增加等特征, 但花期未受明显的影响; 而反义植株表现出明显的“矮化”和“早花”, 且出现植株细弱、叶色加深、叶片和穗变短等特征. 转基因水稻的分析结果表明, (rga5正、反义外源基因已分别整合到水稻基因组中, 并有效表达; 正义植株体内的GA₁平均增加约50%, 反义则降低至对照组的约10%. 结果表明, rga5是水稻赤霉素合成代谢途径中起关键作用的赤霉素20-氧化酶基因, 该序列中11个氨基酸的变异并不影响其功能. 正义表达可增强体内GA的合成, 促使植株生长, 增加株高; 反义转化则抑制了内源GA的合成及植株生长, 导致植株明显的矮化.     

中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ A-Rich区的功能鉴定

DNAβ是近年来在一些单组分双生病毒中发现的一类新型卫星DNA分子, DNAβ对于这些病毒诱导典型的病害症状是必需的. DNAβ上含有3个相对保守的区域: 共同区、βC1基因和A-Rich区(A含量 > 60%). 在对中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(TYLCCNV-Y10)DNAβ βC1基因的功能突变研究的基础上, 对TYLCCNV-Y10 DNAβ上的A-Rich区进行了功能鉴定. 对TYLCCNV-Y10 DNAβ A-Rich区进行缺失突变后发现, A-Rich缺失突变体依然能够在植物中稳定复制和系统移动, 因此A-Rich区对于DNAβ的复制并不是必需的. 免疫捕获PCR检测发现, A-Rich缺失突变体能够包裹在TYLCCNV-Y10 DNA-A编码的外壳蛋白之中, 表明它并不能决定DNAβ的包裹, 但是A-Rich区的缺失使病毒症状减弱.