人胎儿骨髓间充质干细胞的分离及生物学鉴定

通过原代细胞培养,从引产胎儿骨髓组织中分离干细胞,然后进行生物学鉴定,旨在体外建立培养胎儿骨髓干细胞的有效方法,为进一步研究干细胞奠定基础．本研究对四个月的引产胎儿骨髓组织进行原代细胞培养,采用贴壁筛选法,在含有15％胎牛血清的L-DMEM／IMDM(1:1)混和培养液中培养,7 d后细胞可长满瓶底．显微镜下观察,细胞形态均一,呈长梭形．传代后,在8代以内的细胞贴壁能力较强,生长速度较快．将其命名为BMMS-03．在第3代时,对培养的细胞进行了于细胞标志物的生物学鉴定,采用流式细胞仪对经免疫荧光染色的细胞进行检测．结果显示:97．2％的细胞呈CD105阳性反应,66．0％的细胞呈CD106阳性反应, 9．2％的细胞呈CD34阳性反应．阴性对照组阳性反应为0．5％．生物学鉴定的初步结果提示,从胎儿骨髓组织中分离培养成功的细胞为骨髓间充质干细胞,其细胞形态学特征、CD105 、CD106 和CD34-的检测结果均符合间充质干细胞的特征．本研究成功地建立了体外培养胎儿骨髓间充质干细胞的有效方法,所获得的间充质干细胞纯度较高,增殖较快,适用于干细胞生物学和组织工程学的研究．     

鸡肿瘤病快速鉴别诊断试剂盒及其应用研究

建立快速鉴别诊断鸡肿瘤病的聚合酶链式反应技术并研制成配套的诊断试剂盒。应用该试剂盒及其配套的操作程序,在2000年5月～2004年7月检测来源于广西6个地区202个禽群共685羽病、死鸡和火鸡的肿瘤和可疑肿瘤组织病料以及来源于安徽省不同地区的46个鸡群的疑似肿瘤病、死鸡305羽;同时,检测广西、安徽、山东、河南主要养鸡地区临床表现为生长缓慢、消瘦、贫血、疫苗免疫应答不佳、发病率和死亡率偏高等疑为免疫抑制状态的154个鸡群中的644羽病、死鸡。结果,在肿瘤和可疑肿瘤病料的检测中,马立克氏病、网状内皮增生症和禽白血病的阳性率分别为57．17％、11．84％和5．47％,其中二重、三重混合感染总检测率为16．25％。在疑似免疫抑制性疾病病料的检测中,3种鸡肿瘤病的阳性率分别为28．26％、7．45％和4．19％,其中二重、三重肿瘤病以及与其它免疫抑制性疾病的混合感染率达35．92％。建立的鸡肿瘤病快速鉴别诊断程序及试剂盒,操作简便快捷、结果准确可靠、保存方便、检测成本低,适用于临床鸡肿瘤病的鉴别诊断,对鸡肿瘤病的流行病学调查、免疫抑制病检测以及兽医检疫有重要价值。     

鼠痘病毒PCR检测方法的建立及在鼠源性生物制品检定中的应用

目的建立小鼠鼠痘病毒PCR检测方法,并应用于鼠源性生物制品的检测。方法根据鼠痘病毒基因组序列中保守的crmD片段设计一对引物,建立鼠痘病毒PCR检测方法;人工感染20只小鼠,对其肝、脾、肾、脚掌及血液采用该方法进行检测;提取鼠源性生物制品中DNA,采用该方法检测其是否存在鼠痘病毒。结果该方法可以检测到稀释至10-5感染鼠痘病毒的细胞,在BHK21细胞和牛痘病毒中均未扩增出相应片段;该方法可检测出人工感染小鼠不同组织中病毒DNA;在鼠源性生物制品中未检测出鼠痘病毒DNA。结论该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于染病动物组织及鼠源性生物制品中鼠痘病毒的检测。     

喉宝对鸡呼吸道疾病的防治研究

通过纯中草药制剂－喉定和西药红霉素对鸡常见呼吸道疾病的防治研究结果表明：喉宝对人工感染雏允传染性支气管料的保护率达86．7％，具有明显的预防作用（P＜0．01），对传传染性支气管炎、传染性喉气管、慢性呼吸道疾病治疗效果优于红霉素（P＜0．01）。     

人类疱疹病毒6、7、8型与巨细胞病毒对大肠肿瘤致病的协同作用

目的:检测HHV-6、7、8及CMV在大肠肿瘤中的感染,探讨其致病的协同作用。方法:取20例大肠肿瘤标本,其中10例良性病变(炎性息肉、乳头状瘤和绒毛状腺瘤),10例恶性病变(癌和腺瘤恶变)。应用巢式PCR法,分别检测两组病变组织中HHV-6、7、8和MCV的DNA片段。结果:HHV-6检测结果表明恶性病变组阳性反应率为90%(9/10),良性病变组阳性反应率为60%(6/10),其产物为132bpDNA片段;HHV-7检测结果示恶性病变组阳性反应率为40%(4/10),良性病变组阳性反应率为0(0/10),其产物为92bpDNA片段;HHV-8检测结果示恶性病变组阳性反应率为90%(9/10),良性病变组阳性反应率为20%(2/10),其产物为177bpDNA片段;检测CMV结果示恶性病变样本组阳性反应率为100%(10/10),良性病变样本组阳性反应率为100%(10/10),其产物为85bpDNA片段。结论:CMV在良、恶性大肠肿瘤病变中均有较高的感染率,HHV-6、7、8在恶性病变组中感染率较良性组高,是需要警惕的致病因素。     

鼠痘感染的诊断及鉴定方法的研究

本文采用多种检测方法，对临床上怀 鼠痘病毒感染的小鼠进行诊断。     

通辽地区不同人群庚型肝炎病毒感染的研究

目的：研究通辽地区蒙古族、汉族，不同年龄人群庚型肝炎病毒感染及致病性情况．方法：采用了LISA对298例健康人群111例肝炎患者中进行抗-HGV检测．结果：健康人群HGV感染率为2．5％，汉族为1．69％．在肝炎患者中蒙古族HGV感染率38．70％，汉族为18．75％，健康人群HGV感染率为2．01％，肝炎患者为24．32％．结论：蒙古族HGV感染在健康人群还是肝炎患者中都明显高于汉族人群．肝炎患者HGV感染明显高于健康人群．     

地克珠利对藏马鸡柔嫩艾美耳球虫病的疗效

在人工感染柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）的藏马鸡中进行了地克珠利预混剂、地克珠利饮水剂、氯苯胍的抗球虫试验，以卵囊减少率作为主要试验指标，观察其抗球虫效果。结果表明：地克珠利预混剂、地克珠利饮水剂卵囊减少率均为99．5％，相对增重率分别为84．9％和92．9％，而氯苯胍的卵囊减少率为95％，相对增重率为59．1％。表明地克珠利是一种高效的抗球虫药，能有效的控制藏马鸡柔嫩艾美耳球虫病。     

石河子地区部分鸡场马立克氏病血清流行病学

用已知鸡马立克氏病病毒(MDV)抗原和已知MDV血清分别进行琼脂扩散试验,以调查石河子地区部分鸡场MD阳性反应鸡的感染情况,从六个单位,25个鸡群中随机采集样品,共捡573只鸡,感染率为46.22％。     

健康体检者HBV血清标志物组合分析

目的 了解人群中HBsAg携带、感染现状及HBV血清标志物组合。方法采用EHSA法对1257名体检者进行HBV血清五项标志物检测。结果乙肝病毒携带率27．29％，感染率38．50％，HBsAg携带率男性16．55％，女性10．74％，男性高于女性。而抗-HBs阳性率男性显著低于女性343例HBsAg阳性者中“大三阳”11．77％，“小三阳”10．34％。结论对无临床症状的携带感染者要重点进行乙肝防治，进行必要的体检，有利于乙肝病人的早发现、早诊断、早隔离、早治疗及易感人群的保护。     

基于小鼠肝炎病毒研究遗传工程小鼠隔离检疫设计

目的以小鼠肝炎病毒(MHV)为例,研究两种常用小鼠感染MHV后粪便中病毒核酸检测量与血清特异性抗体的变化,探讨实验动物病原微生物感染的检测设计。方法用MHV病毒核酸检测阳性的脏垫料持续饲养C57BL/6和BALB/c小鼠(n=20) 28 d,进行脏垫料接触感染。之后所有小鼠使用无菌垫料进行单笼饲养,每周收集新鲜粪便和血清样本,经Taqman荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法检测后进行统计分析。结果对于BALB/c小鼠,采用qPCR法检测时,在实验第21天即有阳性检出(阳性率20%),第28天阳性检出率达到最高,为80%,第42天阳性检出率为50%,至第56天无阳性检出。血清ELISA检测发现,实验第42天才有MHV特异性抗体检出(阳性率为50%)。对于C57BL/6小鼠,采用qPCR法检测时,在第28天和第42天分别从20%小鼠粪便中检出MHV。而采用ELISA法在整个实验期均未检出特异性阳性抗体。结论在隔离检疫和常规病原检测中,建议选用BALB/c小鼠作为哨兵鼠,替代C57BL/6小鼠。由于qPCR法具有早检出和更高检出率的优点,建议在隔离检疫早期采用基于分子生物学的粪样核酸检测法替代ELISA法。     

宜春地区肺吸虫第二中间宿主：—溪蟹感染情况的调查

自1982年来,全区共采集溪蟹3208只,定性解剖1684只,阳性1258只,感染率为74.70%,其中1只雄性蟹体内检获囊蚴6599只.部体解剖,91.47%囊蚴分布在肌肉、蟹足、螯肢.用新鲜囊蚴人工感染家犬获得成功.其囊蚴、虫卵、成虫均为卫氏并殖型.     

HCV不同基因型对慢性丙型肝炎抗病毒治疗疗效的影响

目的探讨干扰素联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎患者临床疗效的相关影响因素.方法对110例慢性丙型肝炎患者进行PEG-IFNα-2a 180μg/周联合RBV 800~1200 mg/d的标准治疗,并完成治疗后24周随访,同时分析HCV基因型、HCV-RNA定量对持续病毒学应答(SVR)的影响.应用罗氏试剂检测丙肝病毒定量,应用反转录-套式聚合酶链反应(PT-PCR)法检测HCV基因型.结果在110例进行标准联合治疗、并完成治疗后24周随访的慢性丙型肝炎患者中,68例患者获得SVR.其中,HCV基因1b型感染者SVR率为51.4%(37/72),HCV基因N-1b型感染者SVR率为81.5%(31/38);基线HCV-RNA水平1.0×10~5IU/m L的患者SVR率为71.2%(42/59),基线HCV-RNA水平≥1.0×10~5IU/m L的患者SVR率为50.9%(26/51).结论非1b基因型SVR率高于1b基因型;基线低病毒RNA水平(血清HCV-RNA水平1.0×10~5IU/m L)SVR率高于基线高病毒RNA水平(血清HCV-RNA水平≥1.0×10~5IU/m L).     

HCV感染与多种自身抗体高检出率的关系

为探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染后体内出现的自身抗体的病理意义及其引起的自身免疫的发生机制。方法：对１６１例ＨＣＶ感染者进行了八种自身抗体（抗核抗体、类风湿因子、抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺微粒体抗体、抗双链ＤＮＡ抗体、抗ＲＮＰ抗体、抗Ｓｍ抗体、抗精子抗体）的检测。结果：有５２例检出６９项次自身抗体,自身抗体检出率为３２．３％,显著高于健康人对照组（Ｐ＜０．００５）（未计抗精子抗体）。结论：ＨＣＶ感染可能是诱发自身免疫反应的一个重要因素     

广西地区恒河猴(Rhesus Monkey)B病毒相关抗体的检查研究

采用玻片免疫酶法(IEA)和酶联免疫吸附试验法(ELISA),检查了来自广西不同来源恒河猴B病毒的相关抗体。结果表明:广西野生恒河猴受B病毒的感染较为普遍,来自龙虎山及扶绥保护区的猴,B病毒相关抗体阳性率分别是79.7%和75.3%。来自穿洞河及布柳河保护区的猴,B病毒相关抗体阳性率分别是26.1%和28.9%。大新保护区猴阳性率为57.1%。在不同组猴中,小群关养组猴相关抗体阳性率最高,野生猴次之,自繁猴最低。三组间,猴B病毒相关抗体阳性率的差异极显著(P<0.05),经ELISA检查确定为阴性的猴,用IEA检查出7.5%(15/200)的猴被判定为阳性猴。     

非结构蛋白NS1-ELISA检测禽流感野毒感染抗体

利用RT-PCR技术扩增获得了H5N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为678 bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1 mmol／I的IPTG诱导表达5 h,经15％的SDS-PAGE分析表明,诱导表达出了分子量大约为28 KD的 NS1融合蛋白,且以包涵体的形式存在,NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化或用尿素变性复性,获得纯度较高的NS1蛋白,并以此为抗原,建立了检测抗NS1蛋白抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法。最佳包被浓度为2．5μg／ml,血清的最佳稀释倍数为1:200, 酶标二抗的最佳工作稀释度为1:5 000。重组NS1蛋白只与AIV感染的血清反应,而不与ND、IB、IBD、EDS76的阳性血清反应。分别检测H9N2、H5N2和H5N1亚型灭活疫苗和H9N2纯化病毒免疫的血清,各5份,其平均OD490值分别为0．225、0．210、0．205和0．184．均为阴性;而对H9N2和H5N2亚型活毒感染10-15 d的血清进行检测,各5份,其平均OD490值分别为0．610和0．619,均为阳性。因此,NS1蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群,可作为一种鉴别诊断标记,但不能区分亚型．具有A型特异性。NS1-ELISA 方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。     

流行性出血热病毒的细胞培养

用灭活的流行性出血热病毒（EHFV）L99株感染传代培养的Vero-E6细胞,第4d50%的Vero-E6细胞浆内可查到对EHFV鼠血清的特异性荧光,第7-10d阳性细胞数达到100%。用感染第3d的细胞培养上清大批量盲种,第7-10d荧光强度均达到 ,电镜下病毒呈圆形或卵圆形,外膜为电子致密层,界面清楚,包绕着比较疏松的内浆,内浆中有若干个颗粒丝状结构。     

基于数据库分析FOXG1在非小细胞肺癌中的表达和临床意义及稳定过表达FOXG1肺癌细胞株A549的构建

通过TCGA数据库分析FOXG1在非小细胞肺癌中的表达及预后相关性，建立稳定过表达人源FOXG1基因的肺癌细胞株A549。利用TCGA数据库中下载基因表达数据和临床信息，分析FOXG1在非小细胞肺癌和正常组织的表达差异、FOXG1表达水平与临床病理特征及生存预后的相关性并进行基因集富集分析。通过HEK-293T包装慢病毒表达载体，收集病毒上清液侵染A549细胞,嘌呤霉素筛选稳定过表达FOXG1的A549细胞株。细胞核染色鉴定外源FOXG1表达定位，Western blot检测外源FOXG1的表达情况。结果发现FOXG1在非小细胞肺癌组织中高表达，且FOXG1高表达能够降低患者总体生存率。FOXG1的表达水平与患者年龄相关，与性别，分级以及TMN分期无关；细胞周期、P53、Notch等信号通路在高表达FOXG1的非小细胞肺癌组织中被激活；慢病毒表达载体共转染HEK-293T细胞成功；病毒上清液侵染A549细胞，24 h后可见绿色荧光表达，72 h后对照组空载体病毒颗粒侵染效率高达80%左右，实验组过表达FOXG1病毒颗粒侵染效率为50%~60%；经嘌呤霉素筛选培养后，对照组和实验组荧光效率均达到90%以上；细胞核染色外源FOXG1基因定位在细胞核中，Western blot结果显示外源FOXG1在细胞中正确表达。因此可以认为FOXG1基因在非小细胞肺癌患者中高表达，其表达水平与患者总体预后有关且稳定表达FOXG1的A549肺癌细胞株构建成功。     

用双探针原位杂交法检测常见肝病组织中输液传染性病毒DNA

目的：建立肝组织输液传染性病毒DNA(TTVDNA)的原位杂交检测技术，探讨TTVDNA在肝组织中的分布。方法：采用PCR扩增法，分别合成地高辛标记的Gla、G2b两种亚型的双链TTVDNA探针。同时应用两型探针对22例血清学检查无甲-庚型肝炎病毒感染的肝病患者肝组织TTVDNA进行原位杂交检测，并将检测结果与巢式PCR法检测配对血清TTVDNA的结果进行比较。结果：原位杂交阳性信号主要定位于肝细胞核，少数位于胞浆。22例肝病患者肝组织标本中TTVDNA原位杂交阳性率68.2％（15/22），其中慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌患者中原位杂交阳性率83.3％（15/18），4例肝破裂、肝良性肿瘤患者TTVDNA原位杂交检测皆为阴性。配对血清TTVDNA阳性率63.6％（14/22）。血清与肝组织TTVDNA检测符合率86.4％（19/22）。结论：双探针原位杂交检测具有较高的特异性和灵敏性，有助于肝病病因的分析。TTVDNA在慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌的肝组织中检出率较高，提示TTV可能与这些肝病有关。     

流动注射荧光分光光度法在研究氯化钾-铈(Ⅲ)荧光特性中的应用

利用流动注射荧光分光光度分析法研究了Ce~(3+)在KCl介质中的荧光性质.在实验的流动注射条件下,当KCl浓度大于0.3mol/L时,Ce~(3+)在pH<6.2的荧光强度不随酸度改变而变化.据此建立起了Ce~(3+)在pH5～6的流动注射荧光分析法.方法的线性范围是2.0×10~(-7)～2.0×10~(-6)mol/L,一元回归方程为△F=663600 C-0.053(n=10,r=0.9996),检测限为6.0×10~(-9)mol/L,测定频率120～150次/n.方法用于标准土壤、岩石及水系沉积物样品分析.结果与标准值一致,回收率分别为93.6%～102.1%,93.1%～105.8%,97.0%～108.4%(n=10),相对标准偏差分别是1.10%,4.31%,5.10%.