变性剂和巯基修饰对黄精凝集素II构象和活性的影响

采用圆二色谱、荧光光谱,研究了黄精凝集素II(PolygonatumcyrtonemaHua.LectinII,PCLII)在4mol/L和6mol/L盐酸胍中,以及巯基修饰后,其活性和分子构象的变化关系.研究结果表明:PCLII是一种稳定的蛋白质,巯基修饰剂虽不影响其活性,但可使其分子构象发生变化,去除修饰剂后其结构部分能够恢复.在4mol/L盐酸胍中,PCLII活性及构象可发生很大变化,去除盐酸胍后其活性恢复;在6mol/L盐酸胍中,呈现典型的无规卷曲构象,活性完全丧失,去除盐酸胍后活性仍不能恢复,表明活性中心已遭到不可逆的破坏.     

温度、酸碱度和变性剂对黄花石蒜凝集素活性和构象的影响

采用荧光光谱研究了不同温度、pH和变性剂对黄花石蒜凝集素（Lycoris aurea agglutinin,简称LAA）凝血活性和分子构象的变化关系,结果表明：LAA具有较强的温度和酸碱度的耐受性,经过3种变性剂的处理都能使LAA分子构象发生不同程度的变化并导致活性的丧失,浓度为6 mol/L的盐酸胍和脲,20 mmol/L的SDS可以使LAA完全丧失凝血活性,荧光光谱的变化表明了这种变性过程具有阶段性.     

温度和酸碱度对黄精凝集素Ⅱ生物学活性与构象的影响研究

采用圆二色谱和荧光光谱，研究了黄精凝集素Ⅱ(PCLⅡ)在不同温度及不同pH值时，其活性和分子构象变化的关系，结果表明：PCLⅡ具有较强的温度和酸碱度的耐受性，但在80℃，pH2，PH4和pH12时，其分子构象发生较大变化，活性也明显减弱．     

金属离子和变性剂对黄精凝集素Ⅱ构象与功能的影响

黄精凝集素II（Polygonatum cyrtonema Hua.Lectin II,PCLII)具有323nm的荧光发射峰和281．6nm的激发峰,其远紫外圆二色谱（CD谱）显示224nm负峰,分子中含有17．3％的α螺旋和45．8％的β折叠,在10mmol/L的SDS中,PCL II完全丧失兔红细胞凝集能力及促T－淋巴细胞有丝分裂活性,CD谱呈现双负峰的a螺旋构象,去除SDS后,则呈无规卷曲构象,此时,荧光发射峰红移而激发峰蓝移,PCL II仍完全失活,在EDTANa2溶液中,PCL II凝集红细胞能力及促淋巴细胞有丝分裂活性完全丧失,去除EDTA后,红细胞凝集活性完全恢复,但仍失去促淋巴细胞有丝分裂能力,PCL II二级结构变化不大,荧光光谱的变化表明微环境受到影响。     

水稻巯基蛋白酶抑制剂的圆二色谱研究

水稻巯基蛋白酶抑制剂(CPI)圆二色性谱(CD)显示206nm和222nm处的双负峰,CPI分子以α 螺旋构象为主;当CPI与木瓜蛋白酶等摩尔结合后,CPI完全丧失抑制活性,复合物CD谱发生显著变化,α 螺旋含量降低.CPI具有较高的结构稳定性,但在100℃处理时间延长以及pH向酸碱两极变化时,其CD谱发生较大改变,α 螺旋含量减少;而抑制活性仅在pH>9时逐渐下降,在酸性条件下保持不变.用不同试剂修饰CPI分子中的巯基和二硫键,CPI的活性不受影响;DTT、PCMB修饰CPI,其CD谱发生显著变化,NEM修饰CPI,其CD谱变化甚微.4mol/L的脲中,CD谱仅显示206nm负峰、214nm和225～235nm处新的负肩,并在240～250nm之间出现新的负峰,分子中无规卷曲增加,CPI活性未受影响;经NBS修饰,CPI分子中α 螺旋减少,无规卷曲增加较多,CPI完全丧失抑制活性.     

双金属Hg2+和Cu2+对木瓜蛋白酶活性与构象的影响

研究双金属Hg2+和Cu2+对木瓜蛋白酶活性与构象的影响.利用FT-IR、荧光发射以及紫外吸收光谱探讨Hg2+和Cu2+处理与木瓜蛋白酶二级结构变化的关系.研究结果表明:金属离子与木瓜蛋白酶活性之间存在剂量-效应关系,表现出低剂量促进,高剂量抑制的Hormesis现象.低浓度下,双金属Hg2+和Cu2+表现出协同激活效应;高浓度下,Cu2+的添加屏蔽了Hg2+的抑制作用.双金属离子浓度为10-6 mol/L Hg2+和10-8 mol/L Cu2+时,对酶的激活效应最大,其处理的木瓜蛋白酶的有序结构(α-螺旋和β-折叠)含量最高,二级结构最稳定,酶与底物亲和力最强,活性最高.当双金属离子浓度为10-4 mol/L Hg2+和10-4 mol/L Cu2+时,其抑制力最强,处理的木瓜蛋白酶有序结构含量最低,二级结构破坏,活性最低.木瓜蛋白酶分子构象的有序度与其活性呈正相关.     

基于石墨烯分子印迹电化学传感器测定氯霉素

采用改进的Hummers法合成氧化石墨烯,通过共沉淀作用在氧化石墨烯表面生成磁性Fe3O4纳米微粒,经硅烷化修饰巯基,将金纳米颗粒自组装到复合材料中,得到磁性氧化石墨烯复合金纳米颗粒,将其滴涂在金电极表面,以氯霉素为模板分子,通过溶胶-凝胶法将分子印迹膜修饰到金电极上,制得氯霉素分子印迹电化学传感器,并对制备电化学传感器进行条件优化和电化学性能研究。结果显示,基于石墨烯分子印迹电化学传感器测定氯霉素的线性范围为2.5×10-9~5.0×10-6mol/L,检出限为8.0×10-10mol/L。     

h—SOD在脲、胍变性剂中的光谱学特征

研究了人血超氧化物歧化酶（h-SOD)在脲、胍及不同温度下变性的分子构象与活力之间的关系。酶的吸收光谱与酶活力的变化表明：当用不同的变性剂处理后,酶蛋白的空间结构发生了改变,紫外吸收表现出明显的增色效应;酶的荧光强度随脲浓度的增加有所增加随胍浓度的增加明显下降,在4mol/L胍变性条件下,h-SOD的发射峰自337nm红移到353nm,且酶活力明显下降。据此结果推测：酶活力的下降与构象的改变是同步发生的。     

添加剂促进变性还原溶菌酶复性的作用

研究了多种添加剂促进变性还原溶菌酶复性的作用，考察了添加剂浓度及变性剂盐酸胍浓度对复性收率的影响．结果表明，精氨酸、乙酰胺、丙酮、硫脲及甘油均能有效促进变性溶菌酶复性，并且存在最佳的添加剂浓度使变性溶菌酶的复性收率最大．在促进复性中，乙酰胺等结构类似物与盐酸胍具有相同作用，因此，在降低复性液中盐酸胍浓度的同时，适当提高乙酰胺浓度即可获得较高的复性收率．当盐酸胍浓度为0．2mol／L时，复性收率达到90％时的乙酰胺浓度为2mol／L，但降低盐酸胍浓度至0．06mol／L时，达到相同变性收率的乙酰胺浓度需要4mol／L．甘油与盐酸胍存在着协同作用，在一定浓度的盐酸胍存在下，添加适量的甘油能获得较高的复性收率．     

变性剂和缓冲系统对适冷蛋白酶MCP-01和中温蛋白酶BP-01构象影响的圆二色光谱分析何海伦， 陈秀兰*

运用圆二色（CD）光谱分析了适冷蛋白酶MCP-01和中温蛋白酶BP-的二级结构。与BP-01相比,MCP-01具有较低的α螺旋含量和较高的无规则卷曲,表明适冷蛋白酶MCP 01的结构可能具有较高的柔性和较低的稳定性。测定MCP-01和BP-01的变性温度表明,MCP-01的变性温度比BP 01 低10.7℃。测定了变性剂盐酸胍（GuHCl）、2,2,2 三氟乙醇（TFE）对MCP-01和BP-01结构的影响。盐酸胍使MCP-01和BP 01变构的浓度分别为1.0mol/L和3.0mol/L,TFE造成MCP 01和BP 01开始变构的含量分别为20%和30%。这表明,与中温酶相比,变性剂在较低浓度下就可使适冷酶变构,从而造成活性的丧失。检测了两种蛋白酶在保温过程中构象的变化情况。不同缓冲系统明显影响MCP 01的构象稳定性,MCP 01在不同缓冲液中构象稳定性为：碳酸缓冲液相似文献   

鲁米诺—高碘酸钾化学发光法测定盐酸苯乙双胍

在碱性条件下盐酸苯乙双胍对鲁米诺—高碘酸钾化学发光体系有强烈的增敏作用,结合流动注射技术,建立了流动注射化学发光测定盐酸苯乙双胍的新方法.在优化的实验条件下,测定盐酸苯乙双胍的线性范围为4.0×10-9~2.0×10-5 mol/L,检出限为6×10-10 mol/L,对于浓度为4.0×10-8 mol/L的盐酸苯乙双胍连续测定11次,测定值的相对标准偏差为1.1%,以片剂为基体,用标准加入法检验方法的回收率,测得结果在99.6%~100.5%之间.该方法用于盐酸苯乙双胍片剂中盐酸苯乙双胍的定量分析,结果满意     

铋粉修饰碳糊电极循环伏安法测定EDTA的研究

制备了铋粉修饰碳糊电极,实验发现,用此电极为工作电极时,在0.1mol/L盐酸溶液中,于0.0 V(vs.SCE)处富集2min,阴极化扫描,于-0.8V左右获得一灵敏的不可逆还原峰.详细研究了测定EDTA的测定条件,如介质的选择,富集电位,富集时间,扫描速度和修饰剂用量等.在选定的优化实验条件下,峰电流与溶液的浓度在4.00×10-4～2.00×10-3mol/L范围内呈良好的线性关系,其线性回归方程为ip=1.89×10-4～0.0521CEDTA(mol/L), 相关系数为: r=0.9963,检出限为1.30×10-4mol/L.     

rhBACE的克隆、表达纯化与活性测定

将重组人酸性蛋白水解酶原(rh-proBACE)基因克隆到原核表达载体pET28a质粒中，构建了pET28a-rh-proBACE重组表达载体，并在大肠杆菌菌株Rosetta中进行表达,包涵体中的表达产物溶于6mol／L盐酸胍，经Ni-Sepharose亲和层析纯化后，得到高纯度的rh-proBACE蛋白,将此蛋白在复性液中重新折叠后，于酸性条件(pH4．5)下激活，切去酶原序列，产生有活性的rhBACE蛋白，并利用人工合成多肽底物(BAS-131)测定其活性。     

日落黄分子印迹电化学传感器的研制与应用

利用分子印迹技术,以日落黄为模板分子、邻氨基酚为功能单体,采用循环伏安法在石墨电极表面电聚合形成邻氨基酚聚合膜,经电化学方法在0.5mol/L H2SO4溶液中将模板分子去除,制得具有特异识别空穴的日落黄分子印迹修饰电极,然后,采用紫外可见分光光度法和电化学法对聚合薄膜进行表征.实验表明,该分子印迹修饰电极对日落黄有较高的结合速率、特异识别能力和灵敏度,-0.010V处微分脉冲伏安法的峰电流与日落黄的浓度在1.00×10-6～1.00×10-4 mol/L范围内呈良好的线性关系,且检出限为2.00×10-7 mol/L.运用该方法测定了饮料中的日落黄,回收率为95%～108%,为饮料中日落黄的选择性分析提供新的实验方法.     

金属离子和变性条件对野花生豆凝集素活性和构象的影响

野花生豆凝集素在pH7．0和pH5．0缓冲体系中，用EDTA去除其金属离子，CML凝血活性下降．Ca^2 、Mg^2 、Mn^2 、Zn^2 可使去除金属离子CML活性基本恢复到天然水平，表明这些二价金属离子为CML活性所必需．研究不同温度和不同浓度盐酸胍条件下CML的圆二色谱、荧光光谱及其凝血活性的变化，结果表明CML含有较多β-折叠，具有较强的抗变性能力；脲变性的时间扫描荧光光谱证实了CML变性过程的阶段性。     

功能化磁性微粒的合成及表面巯基的测定

目的研究以3-巯丙基三乙氧基硅烷作为Fe3O4磁性粒子表面修饰剂,合成微米级磁响应性好且巯基含量较高的功能化磁性微粒,并对磁性微粒粒径以及表面巯基含量进行表征。方法激光粒度散射仪对功能化磁性微粒进行粒径分析,傅立叶变换红外光谱(FTIR)对巯基修饰前、后磁性微粒表面的功能基团进行表征,E llman方法对功能化磁性微粒表面巯基含量进行定量测定。结果氮气保护,乙醇与水体积比1∶1作为溶剂,500μL浓氨水为催化剂,加入300μL硅烷化试剂与170 mg磁性Fe3O4粒子充分反应,合成了平均粒径约为5μm的巯基化磁性微粒,所建立E llman方法对功能化磁性微粒表面巯基含量的测定结果为357μmol/g。结论功能化磁性微粒表面巯基的修饰及定量测定,为其在生物及医学领域的应用奠定了基础。     

修饰剂对青霉菌葡萄糖氧化酶的效应研究

研究了几种修饰剂对青霉菌(Penicillium amagasakiense)葡萄糖氧化酶(GOD,EC 1.1.3.4)活力的影响.结果表明,溴代乙酸、N-溴代丁二酰亚胺(NBS)、乙酰丙酮等对酶的抑制作用较强,随着抑制剂浓度增大,酶活力呈指数下降,酶活力下降50%的抑制浓度分别为40.8,28.5和8.7 mmol/L,认为咪唑基、吲哚基、精氨酸胍基是该酶的活性功能基团,而蛋白质分子中巯基、二硫键、赖氨酸的ε-氨基、丝氨酸残基与酶活力无关.进一步研究了NBS的抑制动力学,结果显示:NBS对酶的抑制作用为非竞争性可逆抑制,抑制常数(KI)为19.2 μmol/L.该研究对青霉菌GOD在生产上的应用具有一定的理论指导意义.     

茜素红-多壁碳纳米管修饰电极测定尿酸

制备了茜素红-多壁碳纳米管修饰电极,用循环伏安法和线性扫描伏安法研究了尿酸在修饰电极上的电化学行为.结果表明,在pH=1.01的0.2mol/L盐酸底液中,尿酸在修饰电极上出现一不可逆的氧化峰,氧化峰电流与其浓度在2.0×10-6-1.0×10-4moI/L范围内具有良好的线性关系Ip=4.94×10-7 0.248c,相关系数R=0.9957,检出限为1.0×10-6mol/L,人尿样品中尿酸测定的回收率为101.3%-106.5%.     

8—羟基喹啉修饰玻碳电极阳极溶出伏安法测定痕量镉

以8-羟基喹啉(Ox)作为修饰剂制备化学修饰电极,用于痕量镉的伏安法测定.研究了支持电解质种类及酸度、修饰膜厚度、富集电位、富集时间、扫描速度等因素对伏安曲线的影响,获得较为优化的测试条件.在0.1mol/LHAc-NaAc缓冲溶液(pH4.0)中,Cd(Ⅱ)的浓度在4.0×10-8mol/L～7.0×10-5mol/L范围内与其氧化峰电流呈良好线性关系(r=0.9933),检测限达2.0×10-8mol/L.该电极具有很好的重现性,在含2.0×10-6mol/LCd(Ⅱ)试液中连续测定10次,其RSD为7.8%.本法用于实际水样测定,获得满意的结果.     

桄榔蛋白酶的分离、纯化及性质的研究

在桄榔属的Arenga pinnata的果实中,发现了丰富的蛋白水解酶。我们称之为桄榔酶(Arengain)。用硫酸铵将果肉汁分级盐析获得粗酶制品,用DE52层析分出三个蛋白水解活性峰,其中层析成分5为主要活性组分,等电聚焦电泳证实该组分均一,等电点在pH3.99左右,用SDS-PAGE电泳法测算得分子量为44000。 10~(-3)mol/L的Hg~(2+)、PCMB、1AA、DTNB可计量地使酶失活.Hg~(2+)、PCMB抑制了的酶可为EDTA恢复活性。一定时间内巯基乙醇能令酶活性增加。二异丙基氯磷酸虽可抑制酶活性,但先加半胱氨酸,后加二异丙基氟磷酸,可使这种抑制不能实现,证明桄榔酶是巯基酶。酪蛋白做底物,桄榔酶反应的最适温度为60℃,最适pH为pH11。该酶的pH稳定性很好,pH6～12都表现了很高活性.酶液于pH6～12中24小时活性基本不变;该酶还表现了极高的乙醇耐受力,在50％～70％的乙醇中都显示出高活性。它还耐受3mol/L盐酸胍,50％曲拉通,0.1mol/L的二巯苏糖醇。