拟南芥PP2A B′调节亚基β亚型抗体的制备及鉴定

拟南芥中,蛋白磷酸酶2A(PP2A)B′调节亚基有9个亚型,其中α亚型和β亚型是油菜素内酯(BR)信号通路的正调节子,它们能使转录因子BZR1脱磷酸化.选择β亚型特异的一段多肽P109,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了连有HIS标签和GST标签的融合蛋白HIS-P109和GST-P109.以HIS-P109作为抗原,免疫新西兰兔,获得抗体,然后用GST-P109对抗体进行了亲和纯化.利用此纯化的抗体在不同的拟南芥材料中免疫印迹检测β亚型蛋白的表达,证实制备的抗体能与拟南芥PP2AB′调节亚基β亚型特异性反应,为深入研究PP2A在BR信号转导途径中的功能提供了有力工具.     

蛋白磷酸酶2C(PP2C)的表达、纯化与催化活性

从小鼠肌肉组织中提取了总RNA,经RT-PCR,扩增出蛋白磷酸酶2C(PP2C)基因,并构建了pUCm-T载体.经核酸序列分析证明PP2C基因序列正确后,将pUCm-T中的PP2C基因插入pET28a载体中,构建了表达载体pET28a-PP2C,并转化到E.coli BL21(DE3)进行表达.经测定,该菌株表达目的蛋白PP2C的最适条件为:诱导物IPTG的终浓度为0.8 mmol/L,37 ℃,诱导时间为20 h.在此条件下,PP2C实现了高效表达,表达的PP2C蛋白约占菌体总蛋白的18.2%,其中在裂解上清液、沉淀中分别占总蛋白的7.1%和11.1%.经SDS-PAGE分析,表达产物分子量约为42 000.应用Ni-NTA柱实现了可溶性PP2C的纯化,收率达80.5%,纯化的PP2C比活力达34.5 U/mg.     

人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得抗人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)单克隆抗体,以hCG为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到4株分泌抗hCG-β单克隆抗体(McAb)细胞株.酶联免疫吸附测定(ELISA)结果表明,所得抗体均为IgG1,κ型,其腹水效价均可达10-6.     

亚洲黑熊活化素βA亚基基因克隆及分子进化分析

借鉴互联网中已克隆的活化素βA亚基基因的序列.设计并合成一对兼并引物,首次扩增和克隆到亚洲黑熊βA亚基基因的357 bp片段,以水作为阴性对照排除污染,多次重复实验获得一致稳定结果.序列分析显示此片段在处于不同进化程度的物种之间,仍然具有高度的保守性,亚洲黑熊βA亚基基因与人相比有29个核苷酸差异,一致性高达91.6%;与亲缘关系较近的大熊猫、小熊猫和马来熊相比,分别有4、20、3个核苷酸差异,一致性分别为98.9%、94.4%、99.2%.系统发育分析和酶切图谱分析显示亚洲黑熊、大熊猫和马来熊具有较近的亲缘关系,而它们与小熊猫的亲缘关系较远.     

拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备

转录因子AtERF1属于ERF/AP2家族的B3亚家族,参与植物的防卫反应.根据密码子简并原理,用基因全合成的方法合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码拟南芥AtERF1蛋白的碱基序列,并将其克隆到原核表达载体pET-29b.将表达载体AtERF1-pET-29b转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约30kD的AtERF1蛋白,该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在.以该蛋白为抗原免疫家兔,制备出的多克隆抗体经免疫双扩散测定效价达1∶16,Western blot检测表明该抗血清与AtERF1蛋白识别良好.AtERF1抗体的制备为进一步从生化水平上研究AtERF1的功能奠定了良好基础.     

拟南芥转录因子TDF1的原核表达及多克隆抗体制备

在拟南芥花药发育过程中,MYB家族转录因子TDF1在调控绒毡层发育及后期功能上起到关键的作用．利用PCR方法扩增TDF1基因并克隆到原核表达载体pET-32a．将表达载体TDF1-pET32a转入大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG成功诱导表达了分子量约为56KD的TDF1融合蛋白．该融合蛋白主要以包涵体形式存在,分离出包涵体后进行可溶性处理作为抗原免疫家兔．制备出的多克隆抗血清经ELISA测定效价为1：2560,Westernblot检测表明该抗血清与TDF1融合蛋白识别良好．TDF1抗体的制备有助于进一步从生化水平上研究TDF1在花药发育中的功能．     

天然Aβ寡聚体抗体的制备研究

在本研究中,制备了Aβ寡聚体和交联该寡聚体的亲和层析填料,然后应用亲和层析技术从IVIG中纯化获得了结合Aβ寡聚体的多克隆抗体(antibodies against Aβoligomer,Ab-Aβo),并应用ELISA和Western blot对其进行了鉴定,以MTT实验分析了该抗体对Aβ42诱导的细胞毒性作用的影响.结果表明,纯化获得的Ab-Aβo能特异性地结合体外合成或细胞形成的Aβ寡聚体,并且与Aβ寡聚体的结合活性比IVIG高1000倍,同时该寡聚体抗体能够显著抑制Aβ42诱导的细胞毒性.     

蛋白磷酸酶2C（PP2C）的表达、 纯化与催化活性

从小鼠肌肉组织中提取了总RNA, 经RT PCR, 扩增出蛋白磷酸酶2C（PP2C）基因, 并构建了pUCm T载体. 经核酸序列分析证明PP2C基因序列正确后, 将pUCm T中的PP2C基因插入pET28a载体中, 构建了表达载体pET28a PP2C, 并转化到E.coli BL21(DE3)进行表达. 经测定, 该菌株表达目的蛋白PP2C的最适条件为： 诱导物IPTG的终浓度为0.8 mmol/L, 37 ℃, 诱导时间为20 h. 在此条件下, PP2C实现了高 效表达, 表达的PP2C蛋白约占菌体总蛋白的18.2%, 其中在裂解上清液、 沉淀中分别占总蛋白的7.1%和11.1%. 经SDS PAGE分析, 表达产物分子量约为42 000. 应用Ni NTA柱实现了可溶性PP2C的纯化, 收率达805%, 纯化的PP2C比活力达34.5 U/mg.     

Rab39A多克隆抗体的制备与鉴定

制备抗人Rab39A多克隆抗体并进行纯化检测,以用于Rab39A功能的研究.选取免疫原性强且特异性高的羧基端42个氨基酸(176～217aa)作为目的片段.PCR法扩增并构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rab39C42.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化GST-Rab39C42融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.然后以亲和层析法纯化抗体,利用Western blot和免疫荧光检测抗体的特异性.结果表明,构建的原核表达载体经IPTG诱导后高效表达GST-Rab39C42蛋白,纯化后抗体质量浓度为1μg/μL;Western blot实验显示,抗体可以识别外源Rab39A蛋白和多个细胞系的内源Rab39A蛋白;抗体中和实验和RNA干扰实验证明了该抗体具有特异性.本研究成功构建了pGEX-4T-1-Rab39C42原核表达载体,并制备了特异性的抗人Rab39A兔多克隆抗体,为进一步研究Rab39A的功能提供了有力的支持.     

拟南芥钙调素结合蛋白cDNA克隆的分离和初步鉴定

以生物紊标记的钙调素为探针,从拟南芥（Arabidopsis thaliana）λZAP Ⅱ cDNA表达文库中分离到9个阳性克隆．融合蛋白经CaM-gel overlay分析,其中Y1编码的融合蛋白在1mmol／L Ca^2＋存在下与胶体金标记的钙调紊有明显结合．序列测定结果显示其外源片段全长为726bp,含有一个476bp的开放阅读框．GenBank数据库搜索及同源性分析结果表明该序列为拟南芥1号染色体基因组5661～7013序列,编码一未知蛋白,但与真核生物翻译起始因子5A（elF5A）具87％的同源性,并具相似的分子量、等电点和相同的保守序列．与eIF-5A的结构特征比较,可初步确定Y1编码的蛋白为真核生物翻译起始因子5A家族中的新成员．即拟南芥1号染色体5661～7013序列为一尚未报道的翻译起始因子基因＋蛋白质二级结构预测其c端122～135氨基酸残基处有一双亲α-螺旋结构,这一结构与大多数钙调素结合蛋白中的钙调素结合位点的结构特征一致．该序列已提交NCBI Banklt数据库,登录号为AF492850．     

抗SARS-CoV人源Fab抗体的表达及鉴定

为进一步研究抗SARS-CoV刺突蛋白S(Spike)的中和抗体2g7,对其进行了原核表达,将2g7转入琥珀突变的非抑制性菌株(SupE-)的大肠杆菌Top10F'中进行可溶性表达。用HPLC纯化后,SDA-PAGE显示2g7的轻重链均存在,ELISA,Westernblot检测显示2g7能与SARS-CoV的S1蛋白结合。BIAcore测定其与抗原的亲和力为2.67×10-8mol。竞争ELISA显示该抗体能与SARS-CoV刺突蛋白S(Spike)结合并阻断该蛋白与其受体ACE2的结合。实验结果表明:利用免疫噬菌体抗体库能在小库容的情况下筛选获得高亲和性的人源抗体,并可以在大肠杆菌中获得高效表达,这一实验结果为有效性地防治病毒性疾病提供了思路。     

PP2A Cα敲除小鼠心肌细胞模型的构建

体外构建PP2A Cα敲除的原代小鼠心室肌细胞模型.选择性地将雄性PP2A Cαfl/fl,Cre/-小鼠与雌性PP2ACαfl/fl,Cre/-小鼠交配.新生小鼠心脏经胰酶消化后差速贴壁获得原代小鼠心室肌细胞,用带有Cre的腺病毒侵染心肌细胞,经荧光显微镜观察和Western-blot检测,分析PP2A Cα的敲除效果.将基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的雌雄小鼠进行交配,得到其同样基因型的后代,进而可获得足量基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的原代小鼠心肌细胞.用带有重组酶Cre的腺病毒侵染细胞48 h后,可见带有绿色荧光的心肌细胞;Western-blot检测显示,PP2A Cα在Cre腺病毒侵染的心肌细胞可下调60%～80%.本研究成功建立了PP2A Cα敲除的原代小鼠心肌细胞模型.     

小麦高分子量谷蛋白亚基多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

利用丙酮沉淀法对小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW—GS）进行快速高效纯化，以纯化后的蛋白做为抗原，免疫白兔，制备了相应的多克隆抗体．与大肠杆菌裂解液共温育去除交叉反应性抗体，并用饱和硫酸铵沉淀法对抗体进行了初步纯化．电泳及免疫印迹结果表明，所制备的多克隆抗体能与小麦的高分子量谷蛋白亚基发生强烈反应，而与小麦中的水溶性蛋白、醇溶蛋白及低分子量谷蛋白亚基不反应．该抗体的制备为进一步研究小麦高分子量谷蛋白亚基的功能及其品质改良提供了基础材料和有用工具．     

史氏鲟（Acipenser schrenckii）两种促性腺激素β亚基的原核表达

 采用遗传工程方法,重组表达史氏鲟两种促性腺激素β亚基蛋白。选用原核表达载体pET－22b(+),分别插入史氏鲟GtHⅠ&;Ⅱβ亚基成熟肽cDNA序列,构建成C端含有6个组氨酸(6-His)融合蛋白标签的表达质粒;分别转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）并诱导表达2个基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白相对分子质量分别为：GtHⅠβ亚基大约14 000,GtHⅡβ亚基15 000左右。分别用抗6个组氨酸融合标签的单克隆抗体及兔抗鲟鱼GTH多克隆抗体对2个表达蛋白进行Western Blot分析,结果显示重组蛋白表达正确且有较高的免疫活性。GTHⅠβ重组蛋白在2 h就有明显的表达,6 h后随着时间增加表达量不再增加;25 ℃诱导重组蛋白产量比37 ℃诱导产量低。获得的重组蛋白质将可用于建立鲟鱼GtH的放射免疫测定方法。     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜G蛋白β亚基BnGB1基因的过量表达载体pFGC5941-BnGB1和RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Ri-BnGB1,将构建的两个载体分别经根癌农杆菌介导,转化甘蓝型油菜"R197"下胚轴外植体,经过外植体的预培养、共培养以及选择培养后,获得再生植株24株.经PCR鉴定,其中有1株为BnGB1基因过量表达转基因植株,2株为BnGB1基因RNA干扰转基因植株.RT-PCR结果显示,相对于野生型"R197"油菜,过表达转基因植株中的BnGB1基因的表达量提高,而RNA干扰转基因植株中BnGB1基因的表达量降低.     

SLC38A3抗体的制备及细胞内定位

从人胎肝cDNA文库中钓取得到SLC38A3全长cDNA序列.利用生物信息学方法对SLC38A3蛋白序列进行分析,根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择一段多肽序列作为抗原用于抗体制备.将该片段克隆到pET-DsbA融合蛋白表达载体上,在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下产生SLC38A3抗原肽.纯化目的蛋白并制备兔抗SLC38A3蛋白的多克隆抗体.利用Western blot鉴定抗体特异性,并初步分析该蛋白在人肺癌细胞A549内的定位.结果显示,成功构建了SLC38A3片段的原核表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,制备了特异性较高的人SLC38A3蛋白多克隆抗体,并证实该蛋白表达于细胞质内.为进一步研究SLC38A3的生物学功能奠定了基础.     

家鸡生长激素释放激素受体(GHRHR)的蛋白表达与抗体制备

本研究采用RT-PCR等方法,构建编码家鸡两个GHRH受体(GHRHR1和GHRHR2)N-末端胞外结构域的原核表达载体,并在细菌中成功诱导其表达.利用离子亲和层析技术,纯化两受体的重组蛋白片段.在此基础上,利用重组蛋白在兔中制备了两受体的抗体,采用Western blot方法,初步验证这些抗体对垂体以及HEK293细胞中表达的家鸡GHRHR1和GHRHR2识别的有效性.     

肺癌A549细胞COX-2与MMP-2表达的关系

目的:探讨肺癌A549细胞环氧化酶-2(COX-2)表达和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达之间可能潜在的关系.方法:①用Western blot法检测对照组和干预组(5、10、15μg/mL脂多糖(LPS)干预12 h,10 μg/mL的LPS干预6、12、24 h)A549细胞MMP-2蛋白质表达;②用ELISA法检测对照组和干预组A549细胞培养上清液COX-2活性产物前列腺素E2(PGE2)及MMP-2的变化.结果:①在5、10、15μg/mL的LPS 12 h诱导下,肺癌A549细胞MMP-2蛋白表达及MMP-2和PGE2的分泌增加;②10 μg/mL的LPS干预肺癌A549细胞6、12、24 h后MMP-2蛋白表达及MMP-2和PGE2的分泌增加;③肺癌A549细胞PGE2与MMP-2正相关(r1=0.980,r2=0.975).结论:①肺癌A549细胞PGE2与MMP-2密切相关;②肺癌A549细胞可能通过激活肺癌A549细胞MMP-2,参与肺癌的侵袭与转移.     

细胞周期蛋白质依赖性激酶CDK2多克隆抗体的制备和鉴定

我们采用PCR技术合成编码CDK2肽段的基因,将其置于谷胱甘肽转移酶（GST）编码基因的下游,在IPTG诱导下,于E．coli中诱导表达了GST-CDK2肽融合蛋白质,以此融合蛋白质作为免疫原免疫家兔制备抗CDK2的多克隆抗体,经Western Blot检测证明：该抗体能够特异地识别CDK2蛋白质,可作为CDK2的特异性检测抗体,用于研究细胞周期和细胞凋亡进程中CDK2的作用．     

苦荞蛋白磷酸酶2C家族的鉴定及表达分析

为了研究苦荞蛋白磷酸酶2C(PP2C)家族的成员和分类,及后续探究其在苦荞生长发育中的功能,本文利用生物信息学方法对苦荞PP2C家族进行鉴定、分类,并对其基因结构、保守基序、分子进化等进行分析.结果表明,苦荞PP2C家族有81个成员,划分为A-K的11个亚族,并且在同亚族中序列特征相似,而不同亚族间序列特征有一定差异;苦荞PP2C家族有14次基因重复事件.此外,qRT-PCR分析结果表明其A亚族基因在苦荞根、茎、叶、花、果中均有表达,除FtPP2C44外的8个基因在苦荞花、果中表达量较高;在苦荞幼苗中,除FtPP2C08外的8个基因均受ABA诱导表达量上调.上述结果揭示了苦荞PP2C家族的成员组成、序列特征、扩增和其A亚族基因的组织表达模式及受ABA诱导表达情况.