微量量热法研究酸度和金属离子对淀粉酶催化作用的影响

利用热活性检测仪测定了在不同酸度和有抑制剂时淀粉在淀粉酶催化作用下的热功率-时间曲线.根椐酶催化反应动力学理论和对比进度法对实验结果进行处理，确定了酶催化反应的最适酸度，得到了有抑制剂(Li+,K+)时酶催化反应的表现米凯利斯常数（K′m）和最大速率（Vmax）. 定量比较了金属离子对酶催化反应的抑制效果.     

毛霉Amylomyces.rouxii HN0512中内切葡聚糖酶的诱导、纯化及性质分析

Amylomyces.rouxii HN0512经羧甲基纤维素钠(CMC-Na)诱导,可产内切葡聚糖酶,通过正交试验优化诱导培养基,结果在培养基为1％羧甲基纤维素钠、2％麸皮汁、0.2％蛋白胨(以上均为质量分数)时可以诱导出较高活性的酶,用HiTrap QFF阴离子交换层析从培养液上清中纯化得到了具有内切葡聚糖酶活性的P3组分,活性组份的SDS-PAGE分析电泳呈现一条带,经AlphaEaseFCTM软件预测P3的分子质量为18.7 ku;酶反应的最适温度和pH分别为60℃和5.0,在pH 4.0 -7.0范围内稳定性最好,在70℃还能保持50％以上的酶活力;金属离子Fe3+、Ba2+、Fe2和表面活性剂尿素对酶起到了激活作用;反应动力学参数Km和Vmax分别为11.68 mg· mL-1、0.56 μmol·L-1·min-1.本研究获得了一株产内切葡聚糖酶新菌种,并为进一步用基因工程方法克隆并构建重组内切葡聚糖酶基因工程菌奠定了重要的基础.     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的酶催化动力学模型

pH值是影响酶催化反应速率的重要因素之一，建立动力学模型有助于定量分析酶解反应。经典的“三状态”动力学模型未考虑pH值对底物解离状态的影响及产物抑制的作用，该文对“三状态”动力学模型进行改进。在一系列假设基础上提出绿色木霉产纤维素酶水解羧甲基纤维素钠（CMC-Na）的反应机理，建立了pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的动力学模型，推导出反应速率表达式。Lineweaver-Burk作图法求得内切β-葡聚糖苷酶水解CMC-Na在不同pH的动力学参数：K＇m和V＇max，试验最佳初始pH值与模型计算pH值符合，从而模型得以验证。     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ在大肠杆菌中的重组表达及重组酶性质测定

将不含信号肽的瑞氏木霉内切葡聚糖酶II(Cel5A)的cDNA克隆到pET-28a(+)表达质粒上,与其N末端6个组氨酸标签序列融合,构建成pET-28a(+)-egl2表达质粒,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达.利用低温诱导策略,成功表达出活性重组蛋白.Western blot 结果显示重组Cel5A相对分子分量大约为43 000.进一步对重组Cel5A进行Ni-NTA亲和层析柱纯化并对其进行酶学性质测定,结果显示以羧甲基纤维素钠为作用底物时重组酶最适作用pH为4.5,最适作用温度为60℃;重组酶热稳定性较好,在65℃及以下保温1.5 h,活性仍相当稳定.Mn2+对Cel5A的酶活有促进作用,Fe3+和Cu2+有抑制作用,其它金属离子和EDTA对酶活没有明显影响.底物特异性研究表明,重组Cel5A只能水解混合键葡聚糖和羧甲基纤维素钠,对混合键葡聚糖的水解能力是其对羧甲基纤维素钠水解能力的6.7倍,但对微晶纤维素、Glass microfiber filters、木聚糖、阿拉伯木聚糖和木葡聚糖没有水解作用.     

海洋烟曲霉菌产壳聚糖酶的酶学性质初探

对海洋烟曲霉菌产壳聚糖酶的酶学性质进行初步研究,在不同温度、不同pH值的反应系统中,考察酶活随温度、pH值的变化情况.在适宜的温度和pH值条件下,向反应体系中添加一定浓度的金属离子,了解金属离子对酶的作用效果.实验结果表明:该酶适宜的催化反应温度为30～35℃、pH值为6.0,当温度为30～35℃时,保持30 min具有一定的热稳定性;金属离子Mn2+对壳聚糖酶具有较大的激活作用.     

内切葡聚糖酶基因克隆和表达研究进展

纤维素酶包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一,它在能源、纺织、饲料、食品和造纸等行业具有重要的应用。对内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌、酵母和丝状真菌中的克隆和表达进行概述,为内切葡聚糖酶基因工程菌的构建和内切葡聚糖酶的应用提供理论依据。     

内切葡聚糖酶的纯化及其基本性质

纤维素酶是自然界碳素循环中的一种关键酶,它可以将纤维素性材料,转化为可直接利用的葡萄糖,并可通过其它酶和酶系统的作用转化为乙醇及蛋白质。纤维素酶是多酶体系,包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶(Cx)及β-葡萄糖苷酶。其中内切葡聚糖酶含有若干种同工酶,能将可溶性纤维素转化为还原寡糖,是纤维素酶系中的重要组分,为了深入研究Cx酶的性质,本文对其中一种Cx酶进行了分离纯化,并对其基本性质进行了研究。 1实验部分     

纤维素酶降解纤维素的最佳酸度和最佳温度的微量量热法研究

用微量热法测定了不同酸度和不同温度下纤维素酶降解纤维素的热功率-时间曲线，应用热动力学理论和对比进度法解析出反应的米氏常数(Km)和最大速率(Vmax)，并得出速率常数k2，建立速率常数与酸度和温度间的关系式，从而获得纤维素酶降解纤维素的最佳酸度和最佳温度。     

过氧化物模拟酶的研究--四磺基铁酞菁与β-CD的包合物的分析应用

基于四磺基铁酞菁(iron-tetrasulfonatophthalocyanine,FeTSPC)催化反应的性质和-环糊精(-CD)的超分子特性,研究了以FeTSPC和-CD的包合物作为一种新的模拟过氧化物酶对邻苯二胺(OPDA)和H2O2的反应体系的催化作用并用于过氧化氢的定量分析中.研究表明FeTSPC和-CD包合的最适宜条件为1∶1,实验中最佳酸度条件为pH=5.8,最佳反应时间和温度分别为30min和40℃.在此反应条件下,H2O2在2.0105~1.2104mol/L范围内呈良好的线性关系,用此方法对样品中的H2O2的含量进行检测,结果满意.