去泛素化酶及其与人类疾病相关性的研究进展

去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes,DUBs)通过与泛素化靶蛋白的相互作用,切割或去除靶蛋白的泛素链,进而逆转靶蛋白的降解,参与泛素相关的信号转导及人类许多疾病的发生和发展.研究DUBs系统及其与人类疾病的相关性,挖掘出DUBs中新药的靶点对人类健康有重要作用.近年来,针对DUBs的种类、结构...     

过表达E3泛素连接酶ABRv1通过泛素化CPK3提高拟南芥干旱耐受

拟南芥基因ABRv1编码了一个E3泛素连接酶,其表达量受到干旱胁迫的诱导.为了探究ABRv1功能,我们构建了ABRv1的过表达株系并进行干旱处理,结果显示ABRv1过表达株系OE-3具有90.4%的存活率,ABRv1过表达株系OE-7有88.2%的存活率,野生型Col的存活率则为53.8%,而abrv1突变体仅有7.7%的存活率,说明过表达ABRv1提高了拟南芥对干旱的耐受能力.我们还测定了干旱处理下的失水率,也能得出与上述一致的结论.此外,我们使用纯化的GSTABRv1、His-CPK3蛋白进行了体外pull-down实验和体外泛素化实验,结果证明ABRv1能够和CPK3发生相互作用,ABRv1具有E3泛素连接酶活性并且能够把CPK3单泛素化.结果揭示了ABRv1作为一个正调控因子通过泛素化作用底物CPK3参与了拟南芥的干旱胁迫应答过程.     

去泛素化酶7与髓样分化因子88蛋白相互作用的研究

Toll-like受体（TLRs）介导的信号途径不仅参与机体识别病原微生物入侵、诱导免疫应答,而且还可诱导机体产生破坏性炎症反应．通过免疫共沉淀、免疫荧光共定位、间接免疫荧光等实验方法鉴定去泛素化酶7（USP7）和TLR信号途径中重要接头蛋白——髓样分化因子88（MyD88）的相互作用,结果表明USP7和MyD88可在细胞质中共定位并可发生相互作用．该研究对阐释TLR信号通路的机制奠定了重要的基础．     

番茄基因转化研究初报

番茄子叶及下胚轴切段能被含ｎｐｔ－Ⅱ基因和ｍｔｌＤ基因的根癌农杆菌感染，目前已获Ｋａｎ￣ｒ的愈伤组织     

角毛壳菌泛素结合酶基因的克隆和特性分析

利用BlastX将角毛壳菌(Chaetomium cupreum)几丁质诱导的菌丝体cDNA文库中的ESTs序列与NCBI的Nr(Non-redundant)数据库进行相似性搜索,获得泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme,E2)基因的ESTs.以此结果设计引物进行RT-PCR,克隆该基因的cDNA序列(CcE2).该序列长600bp,开放阅读框444bp,编码147个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为16.6ku,是亲水性蛋白.BlastP分析表明该基因进化相当保守,与其他真菌的E2具有高度的相似性;三维结构分析显示CcE2仅包含一个功能结构域,在结构域的中央是决定CcE2活性的半胱氨酸残基活性位点.     

小球藻表达β胡萝卜素酮化酶基因提高虾青素的量

文章以G418抗性基因(NPTⅡ)作为选择标记基因,建立以PBI121为表达载体,农杆菌为介导的小球藻(Chlorella zofingiensis)遗传转化体系。确定了G418质量浓度为0.8 mg/L和羧苄青霉素质量浓度为500 mg/L的小球藻筛选体系,GFP为报告基因,从DNA和RNA水平上鉴定转化子阳性,通过激光共聚焦检测到了GFP的表达,从而建立了农杆菌转化体系。为提高小球藻的虾青素表达量,文章克隆八氢番茄红素脱氢酶基因信号肽PDSSP为信号肽以及克隆β-胡萝卜素酮化酶基因Crto,用overlap聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术构建PDSSP-Crto融合基因,并将融合基因克隆至表达载体PBI121∶35S∶PDSSP-Crto,利用上述农杆菌介导小球藻遗传转换方法转化小球藻。结果表明,转化子小球藻虾青素的质量比为0.564 mg/g,野生型为0.345 mg/g,比野生型高63.5%,有效地提高了小球藻虾青素的表达量。     

RNA内切酶CPSF3受E3D泛素连接酶UBE3D调控

泛素化是泛素分子在系列特殊酶作用下,对靶蛋白进行特异性修饰的过程,该过程参与细胞周期、基因表达、信号传递等几乎一切生命活动的调控,近年来成为开发新药物的新靶点.泛素化研究中,确定E3泛素连接酶和其特异性底物之间的作用是研究的重点和难点,探索底物蛋白翻译后修饰命运,对于研究E3泛素酶的修饰类型具有指示性的作用.E3D泛素...     

番茄SlSL1重组蛋白的表达、纯化及体外泛素化活性检测

泛素化作为真核生物细胞内普遍存在且极为关键的蛋白质翻译后修饰,可以使被修饰的蛋白质发生降解,在植物生长发育、胁迫应答等方面发挥着重要作用。泛素化降解需要通过E3泛素连接酶特异性识别靶蛋白并对其进行修饰,因此E3连接酶在泛素化途径中起着决定性的作用。文章通过克隆番茄SlSL1基因编码序列、构建原核重组表达质粒,并利用诱导表达、亲和吸附纯化SlSL1重组蛋白,以此进行SlSL1的体外泛素化活性检测。SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,由所构建番茄SlSL1基因重组质粒纯化获得SlSL1蛋白;体外泛素化检测显示,SlSL1蛋白形成多聚化泛素条带,具有E3泛素连接酶活性,表明SlSL1可能在番茄的泛素化调控途径中发挥功能。     

转录组和蛋白质组整合分析揭示组蛋白H2A去泛素化酶USP16的功能调控网络

作为主要的H2AK119ub去泛素化酶,USP16与造血功能异常、神经发育、癌症发生等病理过程密切相关。它能够调控染色质的动态性和可及性进而调控转录,也调控细胞周期。尽管USP16在细胞核内发挥功能,但它主要定位于细胞质中。迄今对USP16下游具体的功能网络和信号途径缺乏深入研究。在本研究中,我们通过对来自HeLa细胞和两株usp16稳定敲低细胞系的转录组和蛋白质组数据进行对比整合分析,发现usp16敲低后上调的基因和蛋白主要与细胞骨架形成、细胞形态构建等相关的生物学过程有关,usp16敲低后下调的基因和蛋白与线粒体中的蛋白翻译和代谢过程有关。     

高等植物脂肪酸去饱和酶及编码基因研究进展

生物膜是细胞、细胞器与外界环境连接的界面,是温度胁迫伤害发生的原初位点。细胞膜脂不饱和脂肪酸含量和组分是影响生物膜相变的主要因素,进而影响植物在温度胁迫下的抗性。脂肪酸去饱和酶是脂肪酸代谢过程中的关键酶,调节细胞膜中脂肪酸的含量和组分。笔者根据脂肪酸去饱和酶在催化反应中的先后顺序将其分为3类,分别阐述这3类脂肪酸去饱和酶与温度胁迫下植物适应性的关系,综述了近年来国内外脂肪酸酶去饱和酶及编码基因的克隆、功能鉴定、表达调控等方面的研究进展,对应用基因工程技术培育出温度抗性较强植物品种的研究进行了展望。     

小菜蛾泛素基因的克隆与分析

运用RT-PCR技术,从小菜蛾幼虫总RNA反转录产物中扩增出泛素基因的cDNA序列.利用RNA干扰(RNAi)技术将一段体外合成的与小菜蛾泛素延伸蛋白基因UBA52同源的dsRNA注入四龄幼虫体内,以抑制小菜蛾UBA52基因的表达.半定量RT-PCR结果显示,72 h后沉默组小菜蛾幼虫体内UBA52基因的mRNA表达量显著下调.本实验成功沉默小菜蛾泛素基因,此RNAi干扰体系的建立为利用此技术分析小菜蛾及其他昆虫基因的功能提供了参考.     

桑泛素基因的克隆和表达

根据桑(Morus bombycis)泛素基因编码区的序列(DQ839402.)设计特异引物,用RT - PCR方法克隆桑泛素基因的编码区.序列分析表明,该编码区长240 bp,编码79个氨基酸,软件分析推测编码蛋白的相对分子量和等电点分别为8.74 kD和7.16.通过同源建模获得了桑泛素基因编码蛋白的理论三维结构.将桑泛素基因与pET - 32a(+)连接,构建原核表达载体pET - 32a - ub,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3) 中获得高效表达,并经western bolt 印迹证明实现了原核表达,为进一步研究其作用机理奠定基础.     

水稻泛素缀合酶基因OsUbc13的分子特征和蛋白互作研究

研究目的：通过研究水稻泛素缀合酶基因OsUbc13的序列特征、表达模式、亚细胞定位模式及其互作分子,为深入研究该基因的生物学功能和分子作用机理奠定基础。创新要点：首次对植物Ubc13进行了亚细胞定位研究及蛋白互作研究。研究方法：通过序列比对及聚类分析进行OsUbc13的序列特征研究;通过实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）进行OsUbc13的表达模式分析;通过聚乙二醇（PEG）介导转化烟草BY-2原生质体进行OsUbc13亚细胞定位研究（见图4）;通过酵母双杂交进行OsUbc13的蛋白质互作分析（见图5和表1）。重要结论：OsUbc13编码具有153个氨基酸的蛋白质,其推断的氨基酸序列与其它同源序列具有很高的相似性;该基因在水稻各组织中均有表达,其中内稃、雌蕊、雄蕊和叶片中的表达量较高,而根、茎和外稃中的表达量较低;低温、甲基磺酸甲酯（MMS）和过氧化氢（H2O2）胁迫处理使胚性愈伤中OsUbc13的表达量显著上调,甘露醇、脱落酸（ABA）和氯化钠（NaCl）胁迫则使愈伤组织中该基因的表达量降低;OsUbc13与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白表达于质膜和核膜处;酵母双杂交结果表明约有20个蛋白可能与OsUbc13存在相互作用,其中OsVDAC（与细胞凋亡有关）、OsMADS1（与花器官发育有关）、OsB22EL8（与活性氧清除及DNA 保护有关）和OsCROC-1（为Lys63聚合泛素链形成及运行无误性DNA 损伤耐受机制所必需）四个蛋白经验证确与OsUbc13互作。     

类黄酮3′，5′羟基化酶基因的克隆及转化矮牵牛

类黄酮3′,5′羟基化酶(Flavonoid 3′,5′-hydroxylase,F3′,5′H)是花色素苷代谢途径中的一个关键酶,它使花色素的合成方向趋向于形成蓝色色素翠雀素。利用PCR方法,从“紫蓝色”品系的矮牵牛(Petunia hybrida)总DNA中,克隆到编码F3′,5′H的Hf1、Hf2基因。将Hf2基因正向插入到植物表达中间载体中,通过土壤农杆菌介导的方法转化“淡粉色”品系的矮牵牛。现已得到PCR阳性植株。     

线粒体去乙酰化酶SIRT3与衰老疾病

线粒体去乙酰化酶SIRT3是酵母Sir2同源蛋白,通过对线粒体多种蛋白质赖氨酸的去乙酰化修饰,它可以调控多种代谢过程,如脂肪酸的β-氧化作用、TCA循环、氧化磷酸化等.SIRT3可参与氧化应激反应,降低细胞内ROS水平;也可以作为一种肿瘤抑制因子,促进细胞的凋亡.在某些乳腺癌细胞中,SIRT3表达下调.敲除SIRT3或者SIRT3表达降低,可影响与代谢相关的衰老性疾病如心脏疾病、癌症等的发生.论文总结了近年去乙酰化酶SIRT3在代谢调控及癌症细胞凋亡中的分子机制以及SIRT3与心脏疾病、癌症的相互关系,希望为衰老疾病的预防和治疗提供一定的理论基础.     

AlCl3催化的选择性去甲基反应

AlCl2／CH2Cl2：可在温和反应条件下高选择性脱除邻三甲氧基苯2位上的甲基以及3,4,5-三基苯甲酸甲酯和3,4,5-三甲氧基苯甲酸的4位上的甲基,为选择性脱除芳醚甲基提供了一个新的方法．     

利用基因编辑技术提高番茄GABA含量的研究进展

γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然非蛋白质氨基酸,广泛存在于动物、植物、微生物中,并作为信号分子参与体内多种代谢途径和过程.近年研究发现,γ-氨基丁酸能够有效降低高血压患者的血压,且可以通过长时间的饮食摄入起到预防高血压的作用.番茄(Solanum lycopersicum)作为全世界产量最多的蔬菜之一,在日常饮食中深...     

沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因的克隆

利用同源基因克隆技术克隆沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得的目的基因序列,序列长度541 bp。经局部序列排比检索基本工具(BLAST)检索核酸同源序列,验证分析发现,该序列与大豆、菜豆、苜蓿ω-6脂肪酸去饱和酶基因同源性分别达到76%、75%和74%,说明其确为沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因的部分片段。     

番茄UVR8基因对果实采后贮藏品质的影响

紫外线抗性位点8(UV resistance locus 8,UVR8)编码光受体蛋白,负责UV-B感知和信号转导,被认为参与调控其他的生理反应。文章对UVR8过表达和基因沉默植株的果实进行分析,结果表明：与对照组相比,UVR8过表达转基因番茄果实有着更长的贮藏期,其果实硬度显著高于野生型;对UVR8转基因番茄果实的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性进行测定,结果发现过表达番茄果实的CAT、POD的酶活与野生型相比均显著提高,分别是野生型的2.5、2.3倍,而基因沉默番茄果实的酶活与野生型相比显著下降;同时对脂质过氧化指标的丙二醛(MDA)进行分析,表明每g过表达番茄果实中MDA物质的量有所降低,仅为野生型的1/2,而且每g基因沉默番茄果实中MDA物质的量与野生型相比明显升高。由以上结果可推测,UVR8基因在延长番茄果实采后贮藏期中发挥了作用。