XCRK基因在水稻与细菌性条斑病菌互作中的功能解析

XCRK(Xoc-associated receptor-like kinase)基因是对水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)致病菌侵染应答的差异蛋白质组学研究中发现的一个拟抗病基因.生物信息学分析显示该基因位于水稻的1号染色体上,编码一个含有322个氨基酸的蛋白激酶.组织表达分析显示XCRK基因在根、茎、叶、花序等组织中均有表达,且其表达受高盐、H2O2和脱落酸(ABA)的诱导.为了探究XCRK基因在水稻BLS中的作用,通过PCR扩增XCRK基因编码区,构建超量表达载体,并转化水稻愈伤组织获得了超量表达XCRK基因的转基因水稻植株;同时构建了RNA干扰(RNAi)表达载体,并获得了抑制表达XCRK基因的转基因水稻植株.对T1代转基因植株进行了BLS抗性分析,结果显示:超量表达XCRK基因明显增强了转基因水稻对BLS致病菌的抗性;相反地,抑制表达XCRK基因的转基因水稻对BLS致病菌的敏感性则略有增强.综上结果表明XCRK基因正调控水稻对BLS的抗性,这为进一步研究该基因的作用机制提供了理论依据.     

一个水稻富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的RNAi及表达分析

为了揭示富亮氨酸重复类受体蛋白激酶(LRR-RLKs)家族成员OsLPR1在水稻生长发育与抗逆性中的功能,利用反向遗传学方法构建了OsLPR1的RNAi载体,将其导入野生型水稻中获得转基因植株,观察表型并且分析OsLPR1基因在野生型和转基因植株中的表达情况.在表型观察中发现RNAi转基因植株出现白化苗.进一步的RT-PCR分析发现,白化苗中目的基因OsLPR1的表达量明显偏低,野生型中的表达量则较高,这表明OsLPR1基因表达异常会导致水稻出现白化现象.另外,还分析了OsLPR1的组织特异性表达,结果表明,OsLPR1在不同的组织器官中均有表达,但在叶片及叶鞘中高表达,这说明该基因可能与水稻叶片的生长发育有关.     

小白杏自交不亲和S-RNase基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

为了应用RNAi技术调控杏自交不亲和性状,根据自交不亲和S66-RNase基因序列(Gen Bank登录中)设计特异引物,通过RT-PCR扩增S66-RNase基因(Gen Bank登录中)高变区及下游(63 bp)作为靶基因,构建RNAi表达载体的ihp RNA。以植物表达载体p CAMBIA为骨架载体,利用农杆菌介导的方法转化本氏烟,利用子房转化法转化小白杏。结果显示:获得了长度为439 bp的ihp RNA。表达载体酶切检验表明S66-RNase基因的RNAi表达载体构建和转入农杆菌LBA4404成功。通过抗性筛选和GUS染色检测,获得了16株阳性植株。结论:获得转基因烟草植株证明了本研究构建的RNAi植物表达载体有效,为诱导杏S-RNase基因转录后基因沉默、获得自交亲和的杏提供参考。     

RNA干扰技术及其在医学研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA(dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象.RNAi主要通过核酸酶Dicer切割dsRNA生成21-23 nt的小干扰RNA(siRNA),继而由siRNA识别并靶向降解同源靶基因mRNA,从而抑制靶基因的蛋白表达.近年来,RNAi技术在医学研究中的广泛应用均取得了显著的基因沉默效果,RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段.文中综述了该技术在医学研究中的应用.     

水稻SIDP301基因的克隆与功能分析

水稻是一种重要的粮食作物,也是单子叶植物研究的模式植物,其抗逆相关基因的克隆与功能分析具有重要的理论和现实意义.水稻SIDP301基因编码的蛋白质含有DUF1644家族保守结构域和锌指结构域.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)数据表明SIDP301基因在水稻各个组织中均有表达,其中在根和叶中表达水平较高.SIDP301基因的表达受高盐、高温和茉莉酸诱导.与对照相比,超量表达转基因植株的耐盐性不明显,而抑制表达转基因植株对高盐较敏感.进一步用qRT-PCR检测抗逆相关标记基因,结果表明P5CS、DREB2A、Rab16a和Lea3-1在超量表达转基因植株中的表达量高于野生型植株,而在抑制表达转基因植株中这些基因的表达变化不明显.上述结果说明SIDP301是一个抗逆相关基因,其表达量受抑制时会降低水稻的抗逆性.     

AGO1基因对拟南芥叶边缘锯齿状发育的影响

在拟南芥和水稻中Argonaute(AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合体(RISC)的核心组分,在植物叶极性的分化方面具有重要的调节作用。实验根据AGO1基因序列设计一对特异引物,提取野生型拟南芥RNA作为模板,采用反转录PCR方法扩增出AGO1基因,并插入到克隆载体pGEM-T中。筛选鉴定后将AGO1连接到植物表达载体pBI121上,构建起植物表达载体pBI121-AGO1。并且利用农杆菌介导的方法转化拟南芥,通过抗性筛选,获得转基因植株。然后对转基因植株进行表型分析及AGO1蛋白的RT-PCR检测。通过对转基因拟南芥表达分析发现,与野生型拟南芥相比超表达AGO1蛋白的转基因拟南芥叶片明显呈锯齿状,说明AGO1基因影响拟南芥叶片发育。     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜G蛋白β亚基BnGB1基因的过量表达载体pFGC5941-BnGB1和RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Ri-BnGB1,将构建的两个载体分别经根癌农杆菌介导,转化甘蓝型油菜"R197"下胚轴外植体,经过外植体的预培养、共培养以及选择培养后,获得再生植株24株.经PCR鉴定,其中有1株为BnGB1基因过量表达转基因植株,2株为BnGB1基因RNA干扰转基因植株.RT-PCR结果显示,相对于野生型"R197"油菜,过表达转基因植株中的BnGB1基因的表达量提高,而RNA干扰转基因植株中BnGB1基因的表达量降低.     

小菜蛾泛素基因的克隆与分析

运用RT-PCR技术,从小菜蛾幼虫总RNA反转录产物中扩增出泛素基因的cDNA序列.利用RNA干扰(RNAi)技术将一段体外合成的与小菜蛾泛素延伸蛋白基因UBA52同源的dsRNA注入四龄幼虫体内,以抑制小菜蛾UBA52基因的表达.半定量RT-PCR结果显示,72 h后沉默组小菜蛾幼虫体内UBA52基因的mRNA表达量显著下调.本实验成功沉默小菜蛾泛素基因,此RNAi干扰体系的建立为利用此技术分析小菜蛾及其他昆虫基因的功能提供了参考.     

慢病毒介导的RNA干扰抑制白血病细胞增殖的应用

通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,沉默成人T细胞白血病(ATL)中关键的病毒基因HBZ,并研究RNA干扰后对白血病细胞增殖的影响.首先根据HBZ基因序列设计RNA干扰片段,构建其慢病毒载体,并将其包装成病毒.然后用HBZ siRNA慢病毒感染白血病细胞株TL-Om1,通过RT-PCR和Western blot检测HBZ基因和蛋白表达情况,MTT技术检测沉默HBZ后TL-Om1细胞的增殖情况,利用RT-PCR检测病毒感染后下游生长相关基因的表达.实验结果表明:利用慢病毒介导的RNA干扰技术能有效降低HBZ的表达,进而抑制了白血病细胞的增殖;沉默HBZ后,细胞内E2F1,PCNA和Myc等下游生长相关基因的表达受到了明显抑制.这将为慢病毒介导的RNA干扰技术应用于临床治疗成人T细胞白血病提供重要的实验依据.     

一个新C2H2型锌指蛋白的功能的初步研究

通过筛选人18周胎脑cDNA文库,得到一条编码332AA的全长新基因,生物信息学研究表明,该蛋白质序列有2个C2H2型锌指结构,其中1个锌指结构有RNA－binding蛋白特异锌指的特征,虽然同源比较发现与多种蛋白质精氨酸N端转甲基酶（protein arginine N-methyltransferase) 有一定的同源性,但新锌指蛋白不含转甲基酶的活性功能区域,属功能未知的基因,利用芯片研究功能未知基因的表达是一种较好的手段,通过代谢增强剂PMA（phorbol myristae acetate)刺激培养的血管内皮细胞,观察细胞受激活后新锌指蛋白基因的表达变化,结果表明新基因表达量提高了11倍以上,证实新基因属内皮细胞的极早期应答基因（Immediate early response gene,ERG)。     

RNAi的研究进展

RNAi(RNA interference)是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi是真核生物体抵抗外源基因(如病毒基因、转座子、人工转入基因等)入侵的一种保护性反应，它还是生物体在不同时期通过调控基因表达来调节细胞分化的机制。RNAi已成为一种极为有用的使基因失活的工具应用于多方面的研究中。介绍了RNAi的发现、RNAi的机理、参与RNAi的酶、及其RNAi的应用等有关RNAi的研究进展。     

根癌农杆菌介导的绿色荧光蛋白基因在水稻植株中的表达

将改良的绿色荧光蛋白（EGFP）基因插入到植物表达载体中,构建了ubi启动子驱动下的植物表达载体p13UEGFP．通过根癌农杆菌介导转化水稻的胚性愈伤组织,经潮霉素筛选,获得抗性愈伤组织和再生植株．对T2代植株进行PCR分析、激光共聚焦显微镜检测和RT—PCR分析,结果表明,绿色荧光蛋白基因已经在转基因植株中稳定表达．     

OsNAC2转录因子介导生长素代谢通路调节水稻早期根的发育

NAC家族是植物特有的一类转录因子,在植物的生长发育和逆境胁迫等方面具有重要的功能.研究发现,OsNAC2基因的过表达(ON11)和RNAi(RNAi31)转基因株系,早期主根的长度有显著变化的特征.与野生型日本晴水稻(WT)相比,ON11植株的主根变短,而RNAi31的主根变长.通过对早期OsNAC2pro∶∶GUS株系根尖染色结果表明OsNAC2在根尖具有时序性表达.不同激素诱导OsNAC2表达谱和OsNAC2pro∶∶GUS株系对激素响应结果显示OsNAC2受生长素显著性诱导.结合芯片数据和qRT-PCR分析,OsNAC2转基因株系中生长素合成代谢及信号通路相关基因表达量变化较为明显.同时,ON11根尖淀粉粒发育及其向重力性受到抑制.因此,推测OsNAC2可能通过抑制生长素的合成代谢及信号通路相关基因的表达,降低生长素含量,并参与生长素响应通路,最终影响水稻根的生长.     

过量表达AtA PX2基因提高水稻抗逆性

拟南芥抗坏血酸过氧化物酶2 (Arabidopsis thaliana ascorbate peroxidase 2,AtAPX2)是APX基因家族成员,在拟南芥逆境胁迫应答中起着重要作用。文章通过AtAPX2基因过表达载体构建、农杆菌介导遗传转化,获得AtAPX2基因水稻过表达植株。对过量表达AtAPX2的转基因水稻阳性植株的分析结果显示,其抗过氧化氢能力提高,对高温、盐胁迫耐受能力显著增强,田间植株秕谷率也明显低于野生型。研究结果表明,拟南芥抗坏血酸过氧化物酶基因AtAPX2在水稻中的过量表达,可通过提高清除活性氧能力而用于增强水稻对多种非生物胁迫逆境的耐受能力。     

番茄紫外损伤DNA结合蛋白2(UV-DDB2)全长cDNA克隆及RNAi载体的构建和转化

人类紫外损伤DNA结合蛋白复合体(UV-DDB)由127 kDa 的DDB1蛋白和48 kDa的DDB2蛋白组成.DDB复合体在核酸损伤修复(NER)过程中起到重要作用.本研究通过RACE技术,获得番茄DDB2的全长cDNA序列(1945 bp),具有一个完整的开放阅读框(160bp),编码的氨基酸序列与拟南芥和水稻的DDB2蛋白分别有65.5%和56.1%同源性.利用半定量RT-PCR技术分析表明,DDB2在番茄根、花、嫩叶和幼嫩的果实等分裂旺盛的组织中表达量较高.同时构建了DDB2基因RNA干扰(RNA interference)载体,并利用根瘤农杆菌介导的番茄转化技术获得转基因植株.     

RNA干扰技术在植物中的应用研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一项新的分子生物学技术,是外源和内源性双链RNA(double-strands RNA,dsRNA)在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象。目前,RNAi及相关沉默反应的机制在植物中的研究取得了重大进展,在此对RNAi在植物功能基因组分析、抗逆性、抗病虫害和农作物遗传改良等方面的研究进行概述,以期为RNAi技术在植物上的深入研究提供参考。     

Mi基因过表达载体和16D10基因RNAi载体的构建及转化

文中采用PCR技术从番茄中克隆获得了Mi基因,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从来源于红橘（Citus reticulate）的根结线虫中克隆获得了16D10基因,采用DNA重组技术构建了Mi基因的过表达载体和16D10基因的RNAi载体,分别命名为pB-Mi和pB-16DR. 通过根瘤农杆菌介导的遗传转化,获得了经PCR检测为阳性的沙田柚转基因植株. 这一结果将为研究Mi基因过表达和16D10基因的RNA干扰对柑橘根结线虫病的抗性影响提供试材和技术支持.     

RNA干扰及其在哺乳动物中的应用进展

通过双链RNA(dsRNA)在植物、线虫、果蝇等中进行RNA干扰(RNAi)已获得了很大的成功,但将其应用于哺乳动物却遇到了一定困难.随着各种转染方法的日益改进,以及各种小干扰RNAs(siRNAs)表达载体的出现和不断优化,它们在体内的转录产物(长约21～23nt的双链siRNAs)能特异性抑制哺乳动物基因的表达,使得RNAi应用于哺乳动物系统成为可能. RNAi正在改变以往人们研究哺乳动物细胞基因功能的方式.不仅如此,RNAi正在向病毒、癌症、基因药物研制等方向迅猛发展,文中对RNA干扰及其在哺乳动物中的应用进展进行了综述.     

麻疯树毒蛋白(curcin)基因转化水稻的研究

以粳稻(Japonica)品种日本晴与中花11号为材料,对影响农杆菌介导水稻转化体系的几个因素进行了研究,建立了农杆菌介导的有效水稻转化体系.在该体系中,首次使用浓度为10-4g/mL嘌呤合成抑制剂acivicin在转化前对水稻愈伤组织进行预处理,结果表明此法可有效提高GUS基因的瞬时表达率.同时,利用插入了麻疯树毒蛋白(curcin)基因的植物表达质粒pBI121-curcin,通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株.通过PCR鉴定,证实curcin基因已整合到水稻基因组中.     

osRACD基因表达与光敏核不育水稻光周期育性转换的相关性

为检测水稻低分子量GTP结合蛋白编码基因osRACD与光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换的相关性,用农杆菌介导转化和潮霉素抗性筛选获得了大量的转基因水稻植株.通过PCR、Southern杂交、RT-PCR和Northern检测等,证明反义osRACD基因和正义osRACD基因均已分别在转基因农垦58N和58S水稻植株的幼穗中得到了稳定的表达.成熟转基因植株的自交结实率统计分析表明,反义osRACD基因的表达大大降低了转基因58N水稻植株的育性,其平均结实率明显低于对照植株;而正义osRACD基因在转基因58S水稻植株的幼穗中表达后,使得长日下生长的、本来不育的58S植株的育性得到一定程度上的恢复,有的植株的结实率还高于短日下生长的对照植株;而且,osRACD基因表达水平越高的转基因58S植株,其对应的结实率也越高.降低幼穗中内源osRACD基因的表达水平会导致转基因58N水稻植株的育性降低,恢复长日下生长的转基因58S水稻植株幼穗中osRACD基因的表达,则可恢复其育性.这表明,osRACD基因的表达参与了农垦58S光周期育性转换的调控过程.这是第一个报道的参与光信号传导与光敏核不育水稻光周期育性调控的低分子量GTP结合蛋白的编码基因.