絮凝剂在处理碱性蛋白酶发酵液中的应用

絮凝剂（ＳＰＡＮ）是不同接枝率的演粉与聚丙烯酰胺的接枝共聚物。作为一种高效、无毒、价廉的优良絮凝剂已广泛应用在化工、轻纺、石油开采以及环保工业中。本文进行了将此絮凝剂推广应用到发酵液的预处理中的一系列研究,获得了满意的结果。     

碱性蛋白酶交联聚集体的制备及其催化性能研究

碱性蛋白酶在食品、医药、酿造、丝绸、皮革等行业中发挥着重要作用。制备了碱性蛋白酶交联体,并对其催化性能进行研究。在最佳制备条件下(90%叔丁醇作为沉淀剂,沉淀时间为15min,交联剂浓度为33mmol/L,交联时间为6h),交联酶的酶活回收率为22.6%。与游离酶相比,交联酶的最适pH值向碱性方向变化,由7.5变为8.0,最适温度由60℃变成65℃。酶动力学研究表明,交联酶对酪蛋白的催化水解能力(4.3min-1)比游离酶(3.7min-1)更高。尽管交联酶最大反应速度V_max(9.8mg/(mL·min))低于游离酶(13.3mg/(mL·min)),但交联酶对底物的亲和力K_m(2.3mg/mL)比游离酶(3.6mg/mL)有所增加,而且其热稳定性和酸碱稳定性都得到一定程度的提高。另外,在磷酸盐缓冲液中重复使用5和8批次后,交联酶还能保持82.5%和56.5%的酶活性。     

碱性蛋白酶法制备小麦麸皮蛋白及其性质研究

以小麦麸皮为原料,采用碱性蛋白酶酶解制备小麦麸皮蛋白.以蛋白得率为指标,利用单因素和正交方法对小麦麸皮蛋白的制备工艺进行研究,结果表明酶解小麦麸皮蛋白的最佳工艺条件为固液比1∶10,碱性蛋白酶添加量0.5%,酶解时间5 h,酶解温度50℃,p H值为10.0.在此条件下,蛋白得率可以达到80.83%.同时对制备所得小麦麸皮蛋白的性质进行了研究,结果表明,小麦麸皮蛋白溶解性为63.6%,乳化性为68.3%,乳化稳定性为43.2%,持水性为1.38 g/g,吸油性为1.4 m L/g.     

碱性蛋白酶制备纳米珍珠粉工艺优化

使用碱性蛋白酶处理,考察摇床转速、酶解时间和加酶量对纳米级珍珠粉得率的影响.试验结果表明:10g珍珠粉加入50 mL去离子水,在摇床转速为180 r/min、酶解时间为8 h、酶用量为0.5 g时,纳米级珍珠粉得率为95.2%.凯式定氮实验表明:酶解前后珍珠粉蛋白质的含量分别为24.132%和22.010%,酶解后仅相对减少了0.088.     

雅致放射毛霉AS3.2778碱性蛋白酶的制备及应用

毛酶蛋白酶对大豆蛋白具有较高的水解效率以及对蛋白水解物良好的脱苦效果,因此在大豆多肽的制备方面显示出很好的应用前景。为了开发这一蛋白酶系,采用离子交换,疏水层析及凝胶层析对其进行了分离纯化,从雅致放射毛霉As3.2778的发酵麸曲中分离纯化出一种蛋白酶,其纯度提高了22.7倍,酶活回收16.1%,最终比酶活可达到6094u/mg。电泳分析发现,该蛋白酶在还原及非还原条件下均显示出单一条带,表明该酶已达到电泳纯,并且是一单体蛋白,其分子量大约在32KDa。酶谱分析表明,纯化的蛋白酶仅为原发酵麸曲中三种蛋白酶组分中的一种。以大豆蛋白为底物,探讨了纯化后的蛋白酶对大豆蛋白的水解效果。结果显示,该蛋白酶在55℃,pH8.0～10.0的条件下对大豆蛋白显示出较强的水解能力。对比实验发现,纯化的毛酶蛋白酶对大豆蛋白的水解效果优于Papain、Alcalase及Protamex,表明该蛋白酶具有更为广泛的肽键选择性,对大豆蛋白亲和力更强,在大豆蛋白肽链上存在相对较多的酶切位点。     

木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶水解制备绿豆多肽

用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶顺序水解的方法制备绿豆多肽: 先对水解体系的pH值、 碱性蛋白酶与绿豆分离蛋白的质量比（E/S比）、 水解温度、 绿豆分离蛋白质量分数进行单因素实验; 再在单因素实验基础上, 采用4因素3水平正交实验设计优化碱性蛋白酶水解条件. 获得最佳水解条件为： 绿豆分离蛋白的质量分数为8%, 水解温度为55 ℃, E/S比为8%, pH=9.0. 在最佳顺序水解条件下, 绿豆分离蛋白的水解度达32.58%.     

碱性蛋白酶交联酶晶体的制备及稳定性

研究了用透析平衡法制备碱性蛋白酶晶体的过程,在硫酸铵饱和度为２５％的条件下获得了符合要求的碱性蛋白酶晶体,然后采用戊二醛进行交联,制备出了交联酶晶体,并对其在高酸碱度、高温、有机溶剂或有机溶液中的稳定性进行了研究．实验结果表明,交联酶晶体有较高的稳定性．     

碱性蛋白酶Alcalase水解WGP制备ISWGPH的研究

本文采用ｐＨ－ｓｔａｔ法测定ＷＧＰ的水解度。正交实验确定了Ａｌｃａｌａｓｅ水解ＷＧＰ的最佳工艺条件为：Ｔ＝５０℃；ｐＨ－８．５；「Ｓ」＝１０％；「Ｅ／Ｓ」＝２４ＡＵ／ｋｇ蛋白质；ｔ＝３００ｍｉｎ。将ＷＧＰ水解物的Ｐ 到４．０，离 离后上清液，经活性碳处理处理和干燥后得到了等电点可溶性ＷＧＰ水解－ＩＳＧＰＨ。     

杜邦嗜热菌脂肪酶在黑曲霉中的异源表达

该文将杜邦嗜热菌脂肪酶TDL2在黑曲霉系统中异源表达,并考察TDL2自带信号肽和pCAMBIA质粒信号肽对脂肪酶TDL2表达的影响.利用PCR和无缝克隆技术,将脂肪酶TDL2的编码序列与质粒pCAMBIA0380线性片段拼接,分别构建利用β-葡萄糖苷酶bgl2的信号肽的重组质粒pCAMBIA-TDL2-1和利用TDL2信号肽序列的重组质粒pCAMBIA-TDL2-2.用根瘤农杆菌介导转化宿主细胞A. niger CICC 2213构建组成型黑曲霉工程菌A. niger/pCAMBIA-TDL2-1和A. niger/pCAMBIA-TDL2-2,在发酵120 h后其发酵单位分别达到18.5 U·mL^-1和38.3 U·mL^-1,实现了脂肪酶TDL2在黑曲霉中的异源表达.SDS-PAGE分析和活力测定结果表明:利用脂肪酶TDL2信号肽的工程菌A. niger/pCAMBIA-TDL2-2比利用bgl2信号肽的工程菌A. niger/pCAMBIA-TDL2-1的表达量更大、发酵单位更高.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

裂解多糖单加氧酶在毕赤酵母中的异源表达

裂解多糖单加氧酶(lysate polysaccharide monooxygenase,LPMO)是一类含铜氧化酶,在还原型辅因子存在下可氧化裂解纤维素,对纤维素的降解起重要作用.优化并合成黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)lpmo基因,构建pPICZ_αA-Pclpmo表达载体,电转毕赤酵母GS115实现了分泌表达,重组蛋白表达量为450 mg/L.重组PcPLMO对微晶纤维素催化活性为14 U/mL,对碱预处理的秸秆纤维活性较高,为24 U/mL.PcPLMO具有较好的热稳定性,分别在80、90、100℃保温60 min,残留活性为80%、62%与48%.经Endo H脱糖基化分析,PcLPMO发生了高度糖基化修饰,从而促进了酶的高温热稳定.相关结果可为LPMO协同纤维素酶降解纤维素的应用提供参考.     

耐热碱性磷酸酯酶基因的亚克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据耐热碱磷酸酯酶基因的酶切图谱和ＤＮＡ序列,分别在基因的起始密友子和终止密码子设计２个突变引物。引物的５‘端分别带有ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切全点。通过ＰＣＲ从质粒ｐＴＡＰ１１８Ｂ中扩增获得了ＦＤ－ＴＡＰ基因的全序列。经过酶切将基因亚克隆于高达载体ｐＪＬＡ５０３。     

碱性蛋白酶水解螺旋藻制备抗氧化活性肽的工艺优化

为了提高螺旋藻肽的抗氧化能力与收率,采用单因素实验和响应面法对碱性蛋白酶水解螺旋藻粉制备抗氧化活性肽的工艺条件进行优化。实验结果表明,与木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶相比,碱性蛋白酶对螺旋藻粉的水解能力最强,其最适水解条件为55.46℃、pH值为 6.71、固(g)液(mL)比为1∶10.83。在此条件下,酶解240min,螺旋藻肽的收率为58.50%,与优化前相比,提高了15.61%。所制备的螺旋藻肽具有较强的抗氧化能力,在质量浓度为0.86g/L时,其DPPH·清除能力为77.60%,与优化前相比,提高了7.62%。     

碱性环境水热法制备TiO2纳米颗粒及其在染料敏化太阳能电池中的应用

通过碱性环境水热法制备了TiO2纳米颗粒,以异丙醇钛作为钛源,四乙基氢氧化铵作为碱性解胶剂.研究了四乙基氢氧化铵的浓度以及水热温度对TiO2纳米颗粒的影响.通过XRD、TEM对合成的TiO2晶粒尺寸、晶相以及形貌进行了表征.实验结果表明,使用四乙基氢氧化铵作为解胶剂,合成的TiO2颗粒由纯锐钛矿相组成,形状呈拉长的截断四方双锥结构.由于解胶的碱性环境,在TiO2的表面形成了富氧表面,使得在TiO2纳米颗粒表面更多的是热动力学稳定性更好的(101)和(001)面.制备的平均粒径大小为14 nm的TiO2纳米颗粒用于染料敏化太阳能电池中作为光阳极.通过电化学阻抗谱(EIS)分析了此种TiO2颗粒的电子传输特性.在AM1.5的模拟太阳光下,使用这种TiO2纳米颗粒作为光阳极的染料敏化太阳能电池获得了超过7％的光电转换效率.     

米曲霉碱性蛋白酶基因的克隆表达及水解特性

米曲霉碱性蛋白酶对植物蛋白具有高效的水解能力和较好的脱苦作用.为了便于大量获得该酶以利于工业上的应用,文中通过RT-PCR克隆获得米曲霉碱性蛋白酶基因,将之转化到毕赤酵母KM71菌株中并成功表达,之后用该酶进行牛胰岛素氧化链B链及大豆和花生蛋白的水解试验.结果显示:在10L发酵罐中诱导表达时,发酵液中重组碱性蛋白酶的酶活达4100U/mL;该蛋白酶最适反应pH值和温度分别为8.5 ～9.5和50℃,在pH值为6.0 ～10.0和温度低于40℃时具有较好的稳定性;该酶具有广泛的肽键选择性;该酶对大豆和花生蛋白显示出了强于部分商品化蛋白酶的水解能力.以上结果表明:该重组蛋白酶具有较大的开发利用潜力.     

日本曲霉酸性蛋白酶的分泌表达、性质及其在猪肉嫩化中的应用

为研究日本曲霉酸性蛋白酶的分泌表达、性质及其在猪肉嫩化中的应用。将日本曲霉来源的酸性蛋白酶基因(AjproA1)在毕赤酵母中高效表达,经5L发酵罐高密度发酵后测得该酸性蛋白酶酶活力为669.6U·mL^-1,蛋白质量浓度为6.64mg·mL^-1。氨基酸多重序列比对结果表明:该酸性蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶A1家族,与海枣曲霉来源的酸性蛋白酶同源性最高(73%),是一个新型的酸性蛋白酶。采用强阴离子交换层析柱对该酸性蛋白酶进行纯化得到电泳级纯酶,纯化后分析测得该重组酸性蛋白酶(AjproA1)的最适催化条件为pH值3.0,反应温度为45℃,在pH值为3.0~6.0及温度为40℃以下具有良好的稳定性。该酸性蛋白酶对不同蛋白质水解的分析结果表明,该酶底物水解特异性广泛,对酪蛋白组分中的κ-酪蛋白表现出最高水解活力。利用该酸性蛋白酶对猪肉进行处理,发现该酶能够有效降低猪肉剪切力,起到嫩化效果。研究结果旨在为新型酸性蛋白酶的开发及其在肉类嫩化中的应用提供理论参考。     

冠状耳霉碱性蛋白酶的生产及应用

冠状耳霉（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓｃｏｒｏ ｎａｔｕｓ）属接合菌亚门虫霉目 ,是一种常见的昆虫病原真菌 ,可侵染同翅目、鳞翅目、缨翅目、双翅目、鞘翅目昆虫以及蛛形纲的某些成员。该菌在侵染昆虫完成体壁穿透的过程中常分泌多种酶系 ,主要有蛋白酶、几丁质酶、脂酶、Ｄｎａｓｅ等。这些胞外酶系对侵入昆虫血腔、降解组织、破坏昆虫免疫系统起着重要的作用 ,其中对昆虫体壁降解最重要的酶系是胞外蛋白酶。冠状耳霉分泌的胞外蛋白酶均属碱性蛋白酶 ,该酶在ｐＨ值呈碱性的条件下具有最大酶活力 ,主要是在入侵昆虫坚硬的体壁过程中起水解…     

碱性蛋白酶水解豆粕制备ACE抑制肽水解条件的优化

为了寻求高效的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽制备方法,在实验室条件下利用碱性蛋白酶水解豆粕生产ACE抑制肽,并采用单因素和多因素实验相结合的方法对酶解条件进行优化.结果发现,适当延长碱性蛋白酶的水解时间和提高p H,可大幅度提高ACE抑制肽的抑制活性.单因素和多因素实验综合结果显示,碱性蛋白酶水解豆粕产生ACE抑制肽的适宜水解条件为:p H为9.0,水解温度为50℃,水解时间为4 h,蛋白酶质量分数(酶质量/底物质量)为2.0%,底物质量浓度为40 g/L,在此条件下制备的ACE抑制肽的抑制率可达到97.97%.     

碱性蛋白酶催化的Henry反应

Henry反应是一类重要的碳碳键形成反应，广泛用于各类天然产物和医药中间体合成中．使用碱性蛋白酶催化芳香醛和硝基甲烷之间的Henry反应，在室温的条件下，得到对应的产物，产率高达88％．