白桦BpMYB2基因及其启动子克隆、表达分析

克隆了1条白桦MYB转录因子基因,命名为BpMYB2。实时定量PCR分析表明BpMYB2基因在白桦不同器官和组织内的表达量不同,在直立木木质部中表达量最高,其次是人工弯曲处理2周的对应木、应拉木、花序,在叶和芽中表达量极低; 利用染色体步移技术,获得长度为1 284 bp的启动子序列。启动子进行PLACE分析发现,序列中含有TATA box、ARR1AT、WRKY71OS等元件。构建了由BpMYB2启动子驱动GUS报告基因在植物中的表达载体,命名为BpMYB2-1301,利用农杆菌介导法瞬时转化白桦幼苗,并进行组织化学染色。结果表明:BpMYB2的启动子具有启动子活性,能够驱动GUS基因在白桦中表达; GUS瞬时表达信号在茎、叶柄中较强,在叶片中较弱,说明BpMYB2基因与白桦木质部发育相关。     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

pACT E3质粒的构建及其在转基因烟草中的表达

将1个从棉花中分离的新的启动子ACT E3插入质粒pBI101,ACT E3与GUS基因融合，构建成pACT E3表达载体。通过农杆菌介导转化法将ACT E3/GUS融合基因导入烟草。GUS组织化学染色分析表明，在ACT E3启动子控制下，GUS基因仅在叶片及茎等组织中特异表达。     

甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因启动子遗传转化烟草的研究

蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase,SPS)是调节甘蔗蔗糖合成的关键酶之一.根据课题组已经构建的甘蔗SPS5侧翼序列驱动GUS表达的载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,转化模式植物烟草,获得26棵抗性植株.抗性植株的PCR结果表明,获得3株转基因植株.GUS染色分析说明,SPS的5侧翼序列可以驱动GUS基因表达,SPS的5侧翼序列具有启动子活性.     

褐腐菌Postia placenta SB-12菌株农杆菌介导的转化系统构建

将褐腐菌Postia placenta单核体菌株SB-12的菌丝与带有双元载体的两种农杆菌菌株LBA4404和EHA105共培养,并评估双元载体上驱动抗性基因表达的不同启动子的影响,完成了转化体系的构建和优化.结果表明:两种共培养方法中,用6 d菌龄的菌丝形成的菌丝垫能够被农杆菌有效转化获得转化子.无论采用哪种双元载体,EHA105菌株都比LBA4404更有效地转化菌丝体.用来自受体菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子获得了比其他两种启动子(CaMV35S和trpC)更高的转化效率.这是国际上首次报道该菌株转化体系的构建,为对该菌株进行遗传操作打下了基础.     

拟南芥ACOS5基因启动子的克隆和表达载体构建

花药组织特异性启动子在花药发育的分子遗传学中有重要的研究价值.采用PCR方法克隆了1kb长度的ACOS5基因启动子,并将其连入含有GFP基因的拟南芥表达载体p1300中.电激转化农杆菌GV3101后,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因植株.显微观察显示,转基因植物花药只在绒毡层中有荧光表达.这说明ACOS5基因启动子可以在拟南芥花药中驱动外源GFP基因的特异性表达.     

一个GAP启动子的分析及点突变体构建

甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAP)作为常见的持家基因在微生物中普遍表达,因而其启动子(PGAP)被认为是一个强的组成型启动子;首先,预测并克隆了双叉双歧杆菌的GAP启动子,并利用葡萄糖醛酸苷酶基因为报告基因,分析了PGAP在大肠杆菌和双歧杆菌中驱动表达的强度;不同碳源的发酵实验表明:PGAP在葡萄糖培养基中强度最高,而3种底物类似物对PGAP强度的影响各不相同;对PGAP预测的-10区进行了系列点突变,具有更接近sigma 70启动子共有序列的突变体p MGAP3表现出更高的驱动强度;最后,通过对代表性双歧杆菌PGAP序列的比对,表明在一些核心区域,如可能的TATA盒、转录起始位点、核糖体结合位点高度保守。     

合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体

利用反义 RNA和核酶进行基因表达调控是当今植物分子生物学的研究热点之一 .但在转基因植物中 ,利用 RNA聚合酶 型启动区表达效率不高 .番茄 U3sn RNA基因由 RNA聚合酶 来转录 ,具有较高的转录效率 ,为一般转录效率的 1 0 0～ 1 0 0 0倍 .我们人工合成了番茄 U3sn RNA基因上游启动区 ( 1 5 2 bp) ,构建到番茄 ACC合成酶的反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列的上游 ,然后将“启动区 -反义 RNA-核酶嵌合 DNA序列”插入到植物双元表达载体p GA6 4 3中 ,并用三亲融合法导入农杆菌 LBA4 40 4中 ,为研究 U 3sn RNA上游启动区增强反义 RNA-核酶基因的表达奠定了基础     

水稻OsGASR4基因及其启动子的克隆与表达分析

对前期克隆的水稻GAST基因家族新成员OsGASR4开展研究,利用DNAMAN软件分析水稻OsGASR4进化树;检测GA处理野生型和d 18水稻突变体后OsGASR4表达变化;利用RT PCR方法分析该基因的时空表达特性;克隆了该基因上游长约2 082 bp调控序列,并利用网络工具预测启动子顺式作用元件,构建OsGASR4启动子GUS融合表达载体,通过农杆菌介导的水稻遗传转化.结果表明:OsGASR4蛋白具有典型的GASA保守结构域,启动子里含有多个与激素响应元件、光诱导相关元件以及逆境胁迫响应元件;GA_3处理降低了OsGASR4转录水平;RT PCR检测和GUS染色的结果表明,OsGASR4在水稻茎和幼穗的表达量相对较高.表明OsGASR4可能作为GA信号途径的抑制因子参与水稻茎和穗的早期发育.     

基于形态分类和花粉粒亚显微结构特征的金银花农家品种鉴定

通过研究花粉粒亚显微结构特征,为评价忍冬种质资源、品种分类鉴定及优良品种选育提供依据。采用光学显微镜和扫描电镜对金银花农家品种植株、茎、叶、花和花粉及外壁雕纹进行形态分类鉴定,数据采用SPSS进行统计分析和评价。8个主流农家品种形态性状特征及花粉粒形状、萌发孔及外壁刺状雕纹等均有一定差异。四季花植株杆冠明显,北花1号灌丛状,金银花24号花蕾疏被柔毛,花粉粒呈球形,外壁具极密的刺状雕纹;北花1号和四季花的花粉粒呈三角状球形,外壁具密粗刺状雕纹;大毛花茎枝及花蕾密被长柔毛,金银花16号花蕾密被腺毛和针状短毛,金银花1号、金银花15号及金银花23号花粉粒呈钝三角状球形或类球形,外壁具稀疏刺状雕纹。金银花农家品种的花粉粒形态特征为品种分类和鉴定提供了孢粉学依据。     

龙爪槐枝干溃疡病的病原研究

【目的】鉴定龙爪槐枝干溃疡病的病原菌。【方法】采用组织分离法从龙爪槐枝干溃疡病病枝获得疑似病原菌,并通过野外致病性测定该病原菌,结合该病原菌的形态学特征、rDNA-ITS和EF-α基因序列分析,进行病原菌的种类鉴定。【结果】完成了F6菌株致病性分析的科赫法则实验,证实了其致病性; 鉴定该菌为腐皮镰孢菌复合种[Fusarium solani species complex(FSSC)]。【结论】腐皮镰孢菌复合种(FSSC)为引起龙爪槐枝干溃疡病的病原菌。     

喜旱莲子草与乌蔹莓等植物提取物对松材线虫的毒杀活性研究

【目的】松材线虫病是当前我国林业生产上危害最严重的森林病害。尽管投入了大量的人力、物力和财力,但松材线虫病防控形势依然严峻。化学杀线剂具有环境局限性,研发高效植物源杀灭松材线虫的药剂对控制松材线虫病疫情,同时降低环境化学污染具有重要意义。【方法】采用乙醇浸渍提取法制备喜旱莲子草(Alternanthera philoxeroides)、乌蔹莓(Cayratia japonica)、迷迭香(Rosmarinus officinalis)等30种植物的提取物,测定其对松材线虫的毒杀活性。利用液液萃取法,用乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水等有机溶剂对两种植物中的活性成分进行分步提取,得到药液的质量浓度梯度为10.000、5.000、2.500、1.250和0.625 g/L,并分别测定其对松材线虫的毒杀活性。虫卵悬浮液在25 ℃恒温保湿培养箱内培养,24 h后开始观察,32 h后结束观察。通过镜检统计线虫卵数,并计算相应的线虫卵累计孵化率和孵化抑制率。【结果】采用质量浓度为10 g/L的喜旱莲子草、乌蔹莓乙醇提取物分别处理松材线虫,72 h后线虫校正死亡率均为 100%。喜旱莲子草的乙酸乙酯萃取物和乌蔹莓的水层萃取物中存在主要的杀线活性物质,两种植物萃取物处理松材线虫72 h后的半致死剂量(LC₅₀)分别为0.588 8和0.969 3 g/L。在离体虫卵孵化试验中,喜旱莲子草的乙酸乙酯萃取物对线虫的卵孵化抑制率最大,为79.77%,其次为乌蔹莓的水层萃取物,为46.51%。【结论】可见,喜旱莲子草和乌蔹莓对松材线虫成虫和虫卵均具有较强的生物毒杀活性,可作为新型植物杀线虫剂加以开发利用。     

矢竹地下茎转录组测序及节间生长相关基因表达分析

【目的】揭示竹子地下茎生长发育的分子机制。【方法】利用高通量转录组测序对矢竹含不同发育阶段节的地下茎转录组图谱进行了分析研究,并利用qRT-PCR对节间生长相关基因进行表达模式分析。【结果】共获得了11 976 条平均长度为1 008 bp的单基因簇(unigenes)。NCBI注释显示,63.8%的单基因簇具有注释结果,其中16 254 条unigenes被注释到137 个KEGG(京都基因与基因组百科全书)代谢通路中。MapMan分析共获得了1 864 个转录因子及603 个激素代谢及信号转导相关单基因簇。在功能基因方面,共获得564 个与细胞壁构建相关的代谢基因,其中92 个与木质素合成相关。此外,对9 个与赤霉素、细胞壁合成及细胞骨架组织相关的基因,通过实时荧光定量PCR,分析了它们在节间不同发育阶段的表达模式。结果显示:细胞壁、细胞骨架下游功能相关基因在矢竹地下茎节间快速生长阶段表达最高; 而赤霉素合成及信号传导相关基因则在节间伸长起始阶段最高。【结论】矢竹地下茎生长发育受到从各类激素、转录因子到其下游功能基因等组成的复杂分子网络的协同调控。     

一株促生抗病的樱花内生细菌的分离、筛选和鉴定

【目的】解决樱属植物生产过程中根癌病的发生问题。【方法】采用组织分离法和稀释分离法分别从枝干和叶片中分离内生细菌;采用滤纸片法选拮抗菌,通过形态学、生理学和分子生物学法对筛选菌株进行种类鉴定;通过比色法测定筛选菌株的解有机磷的能力;以特定培养基测定菌株产IAA(anxin)的能力,通过测定OD₆₀₀值判断耐NaCl的能力。【结果】在樱花体内共分离到32株内生细菌,其中从枝条内分离到28株,从叶片内分离到4株。对32株内生细菌进行抑菌活性的筛选,有2株对根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)有明显的抑制作用。另对其中的1株细菌YH-20进行鉴定,鉴定结果为瓦雷兹芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。菌株YH-20具有良好的解有机磷和无机磷作用,其在第7天的解无机磷的量为178.43 mg/L,在第7天解有机磷的量为76.50 mg/L;具有较高的分泌IAA的能力,在第7天IAA的生成量为9.174 μg/mL;可在含10% NaCl的培养基上正常生长。【结论】筛选获得的瓦雷兹芽孢杆菌YH-20菌株具有抗植物根癌病菌和解磷能力,是一株在林木根癌病的防治上有很好应用前景的菌株。     

平安竹纤维形态变异特征及其成因分析

【目的】阐明矢竹矮秆稳定变异体——平安竹纤维形态学特征并初步阐释其变异机制。【方法】利用石蜡切片及数量统计学方法进行显微观测与数据分析; qRT-PCR分析基因相对表达量; UPLC/GC-MS法测定赤霉素含量。【结果】平安竹竹秆不同部位纤维长度、长宽比及壁腔比显著小于矢竹; 但其宽度与腔径值显著大于矢竹; 而其不同部位纤维壁厚值虽小于矢竹,但差异不显著。平安竹地下茎纤维在长度、长宽比、壁厚及壁腔比上显著小于矢竹,但其宽度与腔径值则显著大于矢竹。形态解剖学分析显示,平安竹地下茎纤维细胞形态变异出现于节间活跃生长阶段。赤霉素及细胞壁与细胞骨架相关基因表达量分析结果表明,赤霉素信号途径在平安竹节间生长起始阶段即受到抑制; 而其细胞壁与细胞骨架相关下游功能基因则在其伸长早期与活跃阶段显著低于矢竹; 赤霉素含量分析也证实各赤霉素含量早在平安竹节间伸长起始阶段就低于矢竹。【结论】赤霉素信号途径受抑导致其下游细胞壁与细胞骨架组织相关基因下调是最终导致平安竹纤维细胞生长异常的原因之一。     

大麦黄矮病毒（BYDV）外壳蛋白基因在小麦原生质体中的稳定转化

实验采用ＰＥＧ介导法转化小麦，用ＧＵＳ基因作为标志，用荧光法测定Ａｃｔｌ－ＧＵＳ、Ｅｍｕ－ＧＵＳ、３５Ｓ－ＧＵＳ三种质粒转化小麦细胞后的瞬间表达强度，以比较Ａｃｔｌ、Ｅｍｕ、３５Ｓ三种启动子在小表中的表达强度．结果表明，Ａｃｔｌ和Ｅｍｕ的强度大致相等，均比３５Ｓ强．采用Ｅｍｕ为启动子带ＢＹＤＶＣＰ基因的质粒和经改造过的Ａｃｔ１为启动子带有抗潮霉素选择标记基因的质粒共转化小麦“济南１７７”的原生质体．转化６ｄ后，用潮霉素进行筛选，最后得到两块抗潮霉素的愈伤组织，转化后４个月，经ＰＣＲ检测，证明ＣＰ基因已整合进一块愈伤组织的细胞基因组中．