纳豆激酶的高效表达研究进展

心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)已成为影响人类健康的主要疾病.纳豆激酶(nattokinase,简称NK)是一种由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分泌表达的碱性丝氨酸蛋白酶,具有较强的溶栓活性.文章主要就NK溶栓机理、高效表达方面进行论述,简要概述近年来NK高效表达研究进展,并对未来NK发展趋势进行展望.     

酱油辐照灭菌的研究

酱油是日常生活中广泛食用的一种调味品。当它含杂菌总数超过国家卫生标准时,常用加热灭菌消毒,这种方法耗能源多,还会影响酱油的品质。我们应用80Coγ射线对酱油进行輻照灭菌实验,探讨γ射线灭菌效果,改善酱油的品质。     

纳豆激酶酶学性质研究

通过测定纳豆激酶对4种人工合成底物的水解活性,以及SDS-PAGE电泳分析等,比较了两株高产纳豆激酶菌株发酵产生的纳豆激酶的酶学性质.结果发现两菌株产生的纳豆激酶的最适底物均为N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA;两菌株产生的纳豆激酶对牛纤维蛋白原的水解过程基本一致,反应不同时间,对牛纤维蛋白原不同分子质量的亚基的水解速度不同,9 h后,牛纤维蛋白原基本被全部水解.这为纳豆激酶的进一步研究奠定了基础.     

纳豆激酶酶学性质的初步研究

通过(NH4)2SO4对NK分级盐析浓缩,发现用饱和度为65%的(NH4)2SO4盐析,浓缩10倍,NK回收率最高,可达到87.1%.对其纤溶活性研究表明,NK在40℃以下时,纤溶活性相对稳定,65℃以上时,活性迅速下降;pH<4时,显著抑制NK活性;Mg2+对其纤溶活性有显著激活作用,Zn2+,Ca2+,Fe2+和Cu2+对NK有不同的抑制作用,而Al3+则使NK活性完全丧失.     

纳豆激酶纯化及性质研究

以蒸煮后的大豆为原料通过纳豆菌发酵,生产纳豆激酶.改进纯化工艺以酸法提取和凝胶过滤纯化出比活性为160.8IU/mg的酶制品.该酶制品不仅对纤维蛋白有很好的溶纤作用,而且对大鼠血纤维（拟血栓）也有很好的溶纤活性,实验还证明该酶制品对大鼠新鲜血液有很好的抗凝性能,尤其是该酶制品在pH值为2.45和经胃蛋白酶作用后仍保持较高的活力.同时,该方法制备工艺简便,有0.6%的高回收率,故本方法提取的纳豆激酶制品有望开发成为新型口服溶栓、防栓制剂,以供医疗和保健应用.     

纳豆杆菌纳豆激酶成熟肽基因的克隆与同源性分析

纳豆杆菌 (Bacillusnatto)是从日本传统食品纳豆中筛选出来的 ,它具有较强的溶栓作用 .根据已发表的纳豆激酶基因序列设计一对引物 ,利用聚合酶链式反应 (PCR) ,从纳豆杆菌的基因组DNA中扩增和克隆到纳豆激酶基因 .序列分析表明 ,该纳豆激酶基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献已报道的序列分别有 93.4 %和 94 .5 %的同源性 ,显示了极高的同源性 .但该基因与该室克隆的豆豉溶栓酶基因的同源性仅为 80 .1%,这表明纳豆激酶与豆豉溶栓酶确实不是同一种酶 .     

纳豆激酶液体混菌发酵工艺研究

用实验室复合诱变选育的5株产纳豆激酶正向突变菌株,通过随机组合混菌发酵试验,确定了混菌发酵产NK活性最高的菌株组合为CBL-2-7-10-6、DNS-17-3-15-7和L-5-8-15.随后经过一系列正交试验和单因素试验,确定了这3个突变菌株混合发酵的最佳发酵工艺:发酵培养基中葡萄糖质量分数为4%、大豆蛋白胨4%,MgSO₄ 0.04%,CaCl₂ 0.06%,K₂HPO₄ 0.2%,KH₂PO₄ 0.1%;CBL-2-7-10-6,DNS-17-3-15-7和L-5-8-15这3个突变株接种量分别为670、670和1000μL/100 mL;初始pH7.0,发酵温度31℃,摇床转速160 r/min,发酵时间50h.在该条件下,发酵NK酶活性可以达到4 952.33 IU/mL,是本研究单菌株发酵最高酶活(DNS-17-3-15-7的NK活性2 096.57 IU/mL)的2.36倍.     

重组纳豆激酶的分离纯化及酶学性质的初步研究

将已构建好的表达载体pTYB102转化大肠杆菌,经IPTG诱导,表达出以可溶形式存在的有活性的纳豆激酶．首先对表达条件进行优化,最佳诱导温度是15℃,最佳诱导时间是10h．然后将离心收集到的菌体通过超声波破碎、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100柱层析以及冷冻干燥等步骤进行分离纯化,得到电泳纯的有溶栓活性的纳豆激酶．冷冻干燥品在SDS—PAGE上呈一条蛋白质带．纯化倍数35倍,纯酶比活1147．54．该酶的最适反应条件是45℃,pH8．0．酶活性在pH6．0～11．0,55℃以下稳定．     

纳豆激酶液体发酵条件的优化

采用比浊法连续测定D600 nm值,绘制菌种生长曲线,确定纳豆菌培养条件,并用单因素和正交设计实验的方法对纳豆激酶发酵条件进行优化,确定培养基成分的最优组合为MgSO40.02 g/L,K2HPO40.02 g/L,KH2PO40.01 g/L,CaCl20.02 g/L,麦芽糖0.3 g/mL,大豆蛋白胨0.3 g/mL,最适培养温度是37℃,pH=8.0,最佳接种量为每5 g黄豆接种500μL菌液.用Folin-酚法测酶活,由优化前的31.25 U/mL发酵液提高到158.74 U/mL发酵液,单位产量提高了约5.08倍.通过对纳豆激酶发酵培养条件的初步研究,探索纳豆激酶的生产工艺,为纳豆激酶产业化生产提供理论支持.     

纳豆激酶基因导入番茄的研究

将来源于枯草芽孢杆菌的纳豆激酶(nattokinase,NK)基因转化到人类可以直接食用的,又非常喜爱的蔬菜—番茄中,得到在转录水平表达的转基因植株.通过根癌农杆菌EHA105介导,转化番茄的下胚轴,诱导愈伤组织形成及分化成幼苗,进而再生出完整植株.提取再生植株基因组DNA,通过PCR扩增检测,结果表明纳豆激酶基因已经成功整合到番茄植物基因组中.RT-PCR实验结果证明了纳豆激酶基因在转录水平上有表达.     

高活力纳豆激酶制备及贮藏方法的初步研究

在获得高活力纳豆激酶菌株和发酵工艺的基础上,研究了干燥方法、保藏温度、保藏时间等条件对实验室制备纳豆激酶粗酶制剂酶活力的影响,为该制剂的商品价值和有效开发提供了实验数据．结果表明,冷冻干燥、常温干燥两种干燥方式对NK活性的影响不大;干燥状态下的NK具有较强的抗逆能力,室温保藏150d时,NK活性仍可达到原始状态的80％左右;但极端高温等恶劣条件对NK的保藏和活性有较大的负面影响．     

纳豆芽孢杆菌的相关研究进展

纳豆芽孢杆菌是一种好氧型革兰氏阳性益生菌,具有较强的热、酸碱稳定性,进入肠道后迅速发育成营养性细胞,抑制肠杆菌、肠球菌、致病菌等的生殖,促进双歧杆菌、乳酸杆菌和梭菌等厌氧菌的生长,调节微生态平衡,代谢分泌出多种促进营养物质消化吸收的酶类,强化消化机能,同时刺激机体内的免疫系统产生干扰素等抗菌物质和高强溶栓功效的纳豆激酶,增强动物细胞免疫功能.纳豆芽孢杆菌可作为天燃防腐剂、微生态制剂、饲料添加剂、酶活性增强剂、免疫增强剂,提高食品的保藏期、动物的日增重和产奶率,运用到水体中可起到净化水质、改良底质等的作用.本文对纳豆芽孢杆菌的菌落结构、生长曲线、发酵产物及其功能应用进行综述,为充分发挥纳豆芽孢杆菌的功能,生产新型绿色国民生活所需品,降低生产成本提供理论支撑.     

纳豆激酶产生菌的固体发酵参数优化

对影响纳豆激酶产生菌固体发酵时产酶影响因子如碳源/氮源、含水量、温度、pH和培养时间等进行了优化.实验结果表明,菌株1适宜的固体发酵产酶培养基豆粕:麸皮比为3∶1;菌株2适宜的固体发酵产酶培养基豆粕:麸皮比为1∶1时产酶活性最高;菌株1适宜的培养基含水以50%最好,菌株2以70%最好;培养基初始pH均在7.0时酶活最高;发酵温度均以25℃最好,不易超过30℃;两个菌株的适宜发酵时间分别为36 h(菌株1)和72 h(菌株2).在优化发酵条件下,两个菌株单位发酵物中纤溶酶平均酶活力可分别达到1 407.25 U/g(菌株1)和953 U/g(菌株2).     

纳豆激酶液体发酵条件的优化和调控

1987年日本学者须见洋行首先在日本传统食品纳豆中发现一种具有高效溶栓活性的酶,并将其命名为纳豆激酶（简称NK）。纳豆激酶可以降低血液中的脂肪和胆固醇,可以溶解血栓、净化血液。更重要的是,纳豆激酶等活性能物质可以渗透到毛细血管发挥作用,调节微循环,因而有祛斑美容、治疗顽固性过敏引起的皮肤病的效果。目前已经掀起了开发以纳豆激酶为主要原料的保健品热潮。本文通过对纳豆激酶液态发酵条件进行优化,改善发酵条件,在提高NK产量的同时,降低了生产成本,为工业化生产奠定了基础。     

纳豆激酶高产菌株产酶特点及其干燥工艺的研究

在分析菌株产酶特点的基础上,对纳豆激酶(NK)制剂的干燥技术及其保存效果进行了实验研究.结果表明,不同NK菌株的产酶特征有明显差别;冷冻干燥和静态微波真空干燥都可用于纳豆激酶的干燥处理,其中冷冻干燥适用于纳豆激酶实验室干燥,而静态微波真空干燥适用于纳豆激酶制剂的规模化干燥;同时静态微波真空干燥时温度以不超过50℃为宜,温度过高则NK活性急剧下降,而且物料颜色变黑;NK经过干燥处理后室温贮藏24个月时,NK活性仍可达到其原始酶活的80%以上,研究结果为纳豆激酶制剂的产业化开发和应用提供了实验数据.     

纳豆菌I液体发酵生产纳豆激酶最佳培养基的筛选

利用纳豆菌I液体发酵生产纳豆激酶。对影响生产纳豆激酶的培养基的成分——碳源、氮源、碳氮比以及4种盐浓度进行了筛选。结果表明:当蔗糖3%,蛋白胨2%,KH2PO40.1%,K2HPO40.25%,MgSO40.05%,CaCl20.01%时纳豆菌I产酶效果最佳。     

γ-射线辐照法处理剩余活性污泥的试验研究

采用γ-射线辐照法对城市剩余活性污泥进行处理,探讨了γ-射线辐照对污泥理化性质的影响.试验结果表明,在吸收剂量为0~15 k Gy范围内,污泥的p H和ORP没有显著变化,不会对污泥后续处理处置带来不利影响.污泥碱度有所提高,沉降—浓缩性和离心脱水性得到明显改善,TS、VS、TSS和VSS均有所下降,表明γ-射线可以破解污泥细胞组分,有利于污泥减量.     

营养条件对菌株N1产纳豆激酶的影响

分析了影响N1菌株产纳豆激酶的营养条件,结果表明,半乳糖和酵母膏为最佳碳源和最佳氮源. 据此,采用响应曲面法,优化了营养条件,由回归方程,找出了适合菌株 N1 生长的最佳配方——半乳糖 12.51g/L、酵母膏 4.82 g/L、磷酸二氢钾 1.67 g/L、硫酸镁 0.76 g/L,此时纳豆激酶酶活理论值为 179.08 U/mL.     

~(60)Co-γ射线辐照技术在实验动物饲料灭菌中的应用

在实验动物的管理与饲养工作中,饲料的安全卫生至关重要。有效的饲料灭菌技术是饲料卫生质量的重要保障之一。本文综述了近年来γ射线辐照技术在实验动物饲料灭菌中的应用研究,并归纳了这一灭菌技术的诸多优势。 1动物饲料辐照灭菌发展概况     

^60Coγ射线辐照明胶的研究

~(60)Coγ射线辐照明胶是解决其细菌污染和粘度下降问题的有效方法。试验结果表明,适宜辐照剂量范围为3—5KGy,生产应用一般可控制在3.5KGy。在适宜剂量范围内,对其营养成分无不良影响,18种氨基酸总量比未辐照的对照微增。九十天动物喂养试验证明,对生长发育无不良影响,并有促进作用。血液化验、内脏器官观察和病理检验结果,均无异常改变。微核、染色体致畸、Ames试验均呈阴性。生产应用证明,经辐射可有效地提高产品质量和档次,社会、经济效益十分显著。