家鸡TSHβ、FSHβ和LHβ重组蛋白表达及纯化研究

本文以家鸡冷冻垂体组织为模版,克隆了TSHβ、亚基FSHβ亚基和LHβ亚基的部分特异性功能片段,并用pET原核表达系统构建了它们的原核表达质粒:pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ.利用大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami TM菌株摸索到高效重组表达pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ的IPTG诱导浓度分别为:200μM、25μM和15μM.并在此基础上利用镍离子亲和层析蛋白纯化技术对重组蛋白进行了纯化.     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及二级结构预测分析

通过RT-PCR获得SARS冠状病毒N蛋白基因，分别克隆到原核表达载体pET21a，pET32a和pGEX-4T-1中，将3种重组质粒pET2la-N，pET32a-N和pGEX-4T-1-N分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，细菌中分别表达出约46kD的重组N蛋白、约60kD的6xHis-N融合蛋白和约70kD的GST-N融合蛋白，表达量分别达总蛋白的45％、40％和30％．进一步的分析表明：6xHis-N融合蛋白在大肠杆菌中为可溶性表达，该可溶性组分占细菌裂解液的70％左右，且能被6xHis抗体所识别．用蛋白分析软件对N蛋白进行了序列分析和二级结构预测．SARS冠状病毒N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，有助于进一步结晶后进行X射线晶体衍射分析其结构与功能．     

可溶性人干细胞因子的原核表达和纯化

用Trizol提取人骨髓总RNA,通过RT-PCR扩增人干细胞因子DNA,克隆到pMD18-T载体中并测序．将其定向连入原核表达载体pET32a( ),获得了重组表达载体pET32a( )／hSCF,其cDNA长度为504bp,测序结果与已知序列吻合．然后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,获得37kD的融合蛋白,约占菌体总蛋白量的30％．经Ni^2 -NTA树脂亲和层析柱纯化获得纯度大约90％的重组蛋白．     

SARS-CoVS基因表达及纯化

严重急性呼吸道综合症是由一种新的冠状病毒SARS-CoY引起的．作者通过PCR扩增得到了S蛋白的6个编码片段，并利用表达载体pET28a( )在E．coli BL21中进行了原核表达．通过亲和层析纯化了包含大部分ACE2结合区域的S蛋白片段(S4)．ELISA分析结果表明S4与SARS病人恢复期血清具有良好的反应能力．     

rhBACE的克隆、表达纯化与活性测定

将重组人酸性蛋白水解酶原(rh-proBACE)基因克隆到原核表达载体pET28a质粒中，构建了pET28a-rh-proBACE重组表达载体，并在大肠杆菌菌株Rosetta中进行表达,包涵体中的表达产物溶于6mol／L盐酸胍，经Ni-Sepharose亲和层析纯化后，得到高纯度的rh-proBACE蛋白,将此蛋白在复性液中重新折叠后，于酸性条件(pH4．5)下激活，切去酶原序列，产生有活性的rhBACE蛋白，并利用人工合成多肽底物(BAS-131)测定其活性。     

幽门螺杆菌重组VacA蛋白的表达、纯化和鉴定

建立从幽门螺杆菌空泡毒素A(VacA)原核表达系统pET32a-vacA-E.coliBL21DE3中,表达、纯化和鉴定重组空泡毒素A(rVacA)蛋白的方法.采用不同浓度的IPTG(0.1、0.5和1.0 mmol.L-1)诱导原核表达系统表达rVacA,10%SDS-PAGE检测表达产量,Ni-NTA亲和层析法纯化rVacA,采用HPLC检测其纯度,Western-blotting进行免疫学鉴定.从已构建的VacA原核表达系统中成功表达和纯化了rVacA蛋白,产量约占细菌总蛋白的28.4%,纯度为82.3%.为后续进一步研究该蛋白的生物活性和相关检测试剂盒奠定基础.     

利用天然油体纯化原核表达蛋白的方法研究

以脂肪酶为例,探索一种利用天然油体纯化原核表达蛋白的新方法.将已经构建的脂肪酶和油体蛋白基因的融合表达载体(pET32a-Jco2-Xa-LipA),在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.提取植物天然油体在超声条件下与原核表达蛋白重构,由于油体蛋白的强疏水性和脂肪酶亲水性特性可以使得油体标记的脂肪酶固定在油体的表面.通过Factor Xa消化油体蛋白和脂肪酶之间的链接Linker后,通过离心分离,可快速实现脂肪酶的纯化.     

HPV23 L1蛋白的表达、纯化及活性鉴定

为了制备人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)23亚型的L1蛋白,结合大肠杆菌密码子偏好性,经密码子优化合成HPV23的L1蛋白编码区序列,并将其分别克隆至原核表达载体,成功构建了4种原核表达载体pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1和pESUMO-23L1,随...     

重组SARS冠状病毒S蛋白的原核表达研究

目的克隆表达SARS冠状病毒的主要结构蛋白(S蛋白)。方法合成SARS冠状病毒S蛋白特异性基因片断并克隆入pET32a原核表达载体,转化BL21菌,经IPTG诱导高效表达得到重组S蛋白,并通过W estern印迹对重组蛋白质进行鉴定。结果重组蛋白质经镍柱亲和层析得到了部分纯化,免疫动物后得到SARS病毒的多克隆抗体。结论经E lisa检测,表达的重组S蛋白基本具备检测病人血清中抗SARS病毒IgG和IgM的能力,可进一步用于S蛋白功能研究与SARS诊断试剂盒的研制。     

重组大鼠细胞球蛋白的制备、纯化与活性

通过聚合酶链式反应(PCR)克隆鼠源细胞球蛋白(Cytoglobin,CYGB)基因,构建原核表达载体pET22b-Cygb,转入E.coliBL21(DE3)经乳糖诱导表达CYGB,发现CYGB主要以可溶形式存在,其表达量占可溶性总蛋白的35%以上.通过DEAE阴离子交换柱层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析,CYGB纯度可超过95%.重组表达的可溶性CYGB不但具有过氧化物酶活性,其活性为(3.23±0.12)mkat.(g.min)-1,还能保护胎鼠原代皮肤成纤维细胞减轻氧化应激损伤(H2O2模型).     

丙型肝炎病毒(HCV)截短型E2的原核表达和蛋白纯化

对丙型肝炎病毒(HCV)截短型包膜糖蛋白E2-661基因进行原核表达和纯化.利用PCR法扩增出661 bp的截短型HCV E2区基因片段,并将测序正确的E2-661基因克隆入原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果表明目的蛋白分子量约为35 kDa,主要以包涵体形式大量存在.Western-blot结果显示目的蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清均具有良好的反应原性.并通过镍离子亲和层析方法获得纯化的重组蛋白.以上结果为HCV E2功能的进一步研究奠定了基础.     

人白细胞介素-15表达菌株的构建

从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出白细胞介素15(IL-15)基因.构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒(pET28c(+)-IL-15)含有IL-15基因.经Western blot鉴定证实为IL-15,并实现了在大肠杆菌中的高效表达.表达产物占菌体总蛋白的32%,从而为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用奠定了基础.     

红斑丹毒丝菌C43065株spaA基因的克隆和表达

通过PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组DNA中扩增出编码信号肽除外的成熟SpaA蛋白基因spaA,将其克隆到表达载体pET32a的BamHⅠ和Hind Ⅲ位点上,构建重组表达质粒pET-spaA,转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达N端带有Trx标签的融合蛋白rSpaA,SDS-PAGE检测表达蛋白.DNA测序结果表明,spaA基因大小为1794 bp,编码由597个氨基酸残基组成的成熟SpaA蛋白,SDS-PAGE结果显示在大肠杆菌BL21中成功表达了分子量约为86 kDa的重组rSpaA,为进一步开展SpaA保护区域的研究奠定基础.     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.     

结核杆菌19ku脂蛋白的表达与纯化

目的:通过基因工程技术获得重组结核分枝杆茵19 ku蛋白。方法:应用PCR技术扩增卡介苗的19 ku蛋白DNA序列;以质粒pET28a为表达栽体,构建19 ku重组质粒,然后转化大肠埃希菌BL21(DE3);在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,分别对不同诱导时间的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),凝胶经考马斯亮蓝染色检测蛋白。通过镍柱纯化后获得目的蛋白。结果:重组质粒pET28a-p19测序表明与报道的序列相同。它在大肠埃希菌BL21(DE3)细胞内以可溶性形式表达。不同IPTG诱导时间实验表明重组结核分枝杆茵l9 ku蛋白诱导4 h在大肠埃希菌中的表达量最高。结论:pET28a-p19大肠埃希菌工程株可高表达结核分枝杆菌重组19 ku蛋白。     

牛泡沫病毒BFV3026 gag基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从牛泡沫病毒BFV3026感染的胎牛肺细胞中提取Hirt DNA,PCR扩增BFV3026　gag基因。序列分析确证后，将其克隆于原核表达载体pET32A，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，使Gag蛋白得以高效表达。SDS－PAGE及Western blot证实：表达蛋白占菌体总蛋白的40%，本工作的完成为Gag蛋白功能的研究奠定基础。     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

人胰高血糖素样肽-1串联体的克隆及其表达

为大量获取人胰高血糖素样肽-1,利用基因串联的方法构建了人胰高血糖素样肽-1的一组串联体.将化学合成的人胰高血糖素样肽-1（human glucagon like peptide-1, hGLP-1）cDNA基因插入质粒载体pET-32a(⁺)中,构建成硫氧还蛋白（thioredoxin）及六聚组氨酸（hexahistidine）与rhGLP-1的融合表达载体pET32-GLP-1.在此基础上将该融合基因序列进行同向串联,获得二串和三串的表达载体pET32-GLP-1-2 和pET32-GLP-1-3.将该三种表达载体转化大肠杆菌BLR(DE3)后获得相应的基因工程菌.结果表明：三种基因工程菌经发酵和IPTG诱导后均正确表达目的蛋白,目的蛋白表达量随着基因串数的增加而得到一定提高,重组蛋白经分离纯化后进行生物学活性测试具有明显的降低血糖浓度作用.