山羊Apaf-3基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

对单胎藏山羊和多胎金堂黑山羊Apaf-3基因cDNA克隆、序列分析及组织表达特性研究.采集5只多胎金堂黑山羊和5只单胎藏山羊在发情期的卵巢、垂体等组织样,进行Apaf-3基因的cDNA克隆、序列分析,并采用定量PCR技术对其mRNA进行组织表达量研究.结果,克隆出山羊Apaf-3基因长度为1731bp编码区全长为1245bp,编码414个氨基酸.Apaf-3基因在两种山羊中序列相同,且在5种组织中的表达均无差异.同源性分析表明凋亡基因Apaf-3在动物的进化中保守性低,与山羊多羔性状的相关性需要进一步研究.     

翘嘴鳜UCP3基因cDNA的克隆及其胚胎发育表达分析

本研究采用RT-PCR、3′-RACE和5′-RACE技术,从翘嘴鳜胚胎组织中克隆得到UCP3基因的全长cDNA序列(登录号:KP244309)为2 917bp。生物信息学分析表明:翘嘴鳜UCP3基因编码区为930bp,总共编码309个氨基酸;带负电荷的氨基酸残基数22个,带正电荷的氨基酸残基数35个。翘嘴鳜UCP3发育表达分析表明,UCP3在受精期、二细胞期、囊胚期、肌效期、心搏期、仔鱼期有低量表达,从囊胚期到神经胚期显著性增高并达最大值,神经胚期到肌效期显著性降低,肌效期、心搏期、仔鱼期都保持在低水平表达。     

豌豆cop1 cDNA的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以拟南芥cop1 cDNA为探针,从豌豆(Pisum sativum) cDNA文库中克隆到了豌豆cop1 cDNA。序列分析表明,它全长为2863bp,其中包括604bp 5′非编码区、243bp 3′非编码区和2016bp编码区,编码672个氨基酸。在大肠杆菌中实现了豌豆cop1基因的高效表达。对拟南芥、豌豆和番茄3种植物cop1的序列同源性比较表明,cop1可能是一种进化上很保守的蛋白质。     

鳜鱼肥胖基因的克隆与组织表达

为了研究脊椎动物肥胖基因(obese gene, ob)结构与功能关系,利用PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肥胖基因全长序列:鳜鱼ob基因全长1 398 bp, 由2个外显子和1个内含子构成,其完整的开放阅读框由486 bp组成,编码161个氨基酸. 应用Genome Walker方法克隆得到一段长为357 bp的鳜鱼ob基因5′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个保守的顺式调控元件. 我们将克隆得到的鳜鱼ob基因编码氨基酸序列leptin与其他物种leptin序列分别进行同源性比较,并构建系统进化树,发现虽然不同物种间leptin序列差异非常大,但进化树分析显示所有的leptin序列,包括哺乳动物、两栖动物和真骨鱼类,各自聚集成簇. 最后通过荧光实时定量PCR方法研究鳜鱼不同组织ob基因的表达水平,与哺乳动物ob基因主要在脂肪组织表达分布不同,鳜鱼ob基因在所有被检测组织中均有表达,在肝脏组织中大量表达,其次是脑,在肠道、脂肪、脾和肌肉中只有微量表达,说明鱼类ob基因的表达分布及其调控机制可能与哺乳动物存在差别.     

黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析

从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因（AmCHS）cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸。其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS 具有的活性位点和催化位点等保守性位点.     

黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析

从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因（AmCHS）cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸.其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS具有的活性位点和催化位点等保守性位点.     

猪AIBP基因的克隆与组织表达谱研究

扩增了猪AIBP基因CDS和3′端,测序得到全长935bp的cDNA序列,NCBI登录号为DQ826508。猪AIBP基因编码288个氨基酸,与牛、人、鼠的AIBP氨基酸序列的相似性分别为94%、90%和87%,含有1个YjeF-N保守结构域,有信号肽序列。组织表达分析表明猪AIBP在背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、子宫、睾丸、胚胎和脂肪等组织均有表达。     

珍珠鸟和家鸡甲状旁腺激素3型受体(PTH3R)的结构与表达图谱分析

本研究采用RT-PCR方法,首先克隆珍珠鸟和家鸡的PTH3R基因全长cDNA序列.结果显示,家鸡PTH3R(cPTH3R)cDNA全长1632bp,编码543个氨基酸,珍珠鸟PTH3R(zPTH3R-w)cDNA序列全长1563bp,编码520个氨基酸,其蛋白均含有信号肽序列、七次跨膜区等特征性结构.此外,在珍珠鸟中还发现一个新剪接变体zPTH3R-v1,其cDNA序列全长1468bp,编码488个氨基酸,其缺失第3外显子进而导致第1跨膜结构域缺失.利用生物信息学方法,我们还对珍珠鸟和家鸡PTH3R蛋白序列进行三维建模.采用RT-PCR方法,本研究也对珍珠鸟PTH3R基因进行组织表达分析.结果显示,zPTH3R及其剪切变体zPTH3R-v1在珍珠鸟脑及外周组织中广泛表达.     

盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因克隆及序列分析

为了克隆盘羊与巴什拜羊杂交后代短鄂、肺及鼻咽上皮细胞克隆1(SPLUNC1)基因cDNA全长序列,本研究根据GenBank上已公布的牛、山羊的SPLUNC1基因序列来设计简并引物,以盘羊与巴什拜羊杂交F1代为材料,克隆出盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的片段序列,再利用RACE法克隆其SPLUNC1基因3′端和5′端,测序后拼接获得SPLUNC1基因全长cDNA序列。结果显示,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的cDNA全长为1117 bp,5′非编码区(UTR)为84 bp,3′UTR为265 bp,开放阅读框(ORF)为768 bp,编码255个氨基酸。预测该基因编码蛋白的等电点5.006,分子量26.57 kDa。系统进化分析表明,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列同源性最高。本研究克隆了盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因全长cDNA序列,为后续深入研究该杂交后代SPLUNC1基因的功能奠定基础。     

猪色素上皮衍生因子的电子克隆及序列分析

用鼠的色素上皮衍生因子cDNA序列在猪的ESTs库进行BLASTn搜索,得到一系列不同大小的ESTs片段,经拼接得到完整cDNA序列.序列分析显示该cDNA长1 425 bp,有一个1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸,5’非编码区长53 bp,3’非编码区长130 bp,有一个加尾序列和多聚腺苷酸尾巴.其核苷酸序列与牛、人和鼠的同源性分别为89%、87%和82%,氨基酸的同源性分别为89%、87%和84%,且有保守的糖基化位点、半胱氨酸位点和serp in基序,说明所克隆的cDNA序列为猪的PEDF全长cDNA.     

猪Akt1、Akt2基因克隆与组织表达图谱分析

为了得到长白猪蛋白激酶Akt1和Akt2基因序列并分析其表达模式,本研究使用RT-PCR方法,首先克隆了蛋白激酶Akt1和Akt2的cDNA.序列分析显示:长白猪Akt1基因的cDNA全长1461bp,编码具480个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠同源性达到97%以上.长白猪Akt2基因cDNA全长为1505bp,编码具481个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠的同源性高达97%以上.SMART分析表明,猪Akt1和Akt2蛋白均包含了与PI-3K结合的PH结构域及2个具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域.RT-PCR检测结果显示:Akt1mRNA在垂体、心脏、肝脏、脾脏、肌肉组织中高表达,在大脑、小脑、肾脏表达丰度较低.Akt2则在小脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏和肌肉组织中高表达,而在大脑和肾脏中表达丰度较低.     

人原肌球蛋白结合蛋白3(TMOD3)cDNA的克隆及功能初步分析

从人的胎脑cDNA文库到中克隆到1条人原肌球蛋白结合蛋白3（TMOD3）基因,该基因cDNA序列长1402bp,可以编码352个氨基酸残基组成的蛋白,与大鼠,果蝇和线虫的原肌球结合蛋白同源性分别为82％,41％和35％,TMOD3基因定位在人15q21.1-q21.2,位于遗传位标D15S146和D15S117之间,采用基因芯片杂交的方法研究其表达谱概况,发现该基因在多种,组织和细胞中均表达。     

甘薯类胡萝卜素合成酶基因pds全长cDNA的克隆

根据双子叶植物类胡萝卜素合成结构基因氨基酸保守区域设计简并引物,扩增出甘薯编码类胡萝卜素合成关键酶PDS的基因(pds)cDNA中间片断。通过5'-RACE和3'-RACE技术进行cDNA末端的快速扩增,成功地克隆了pds的全长cDNA。序列分析表明,pds基因的全长cDNA序列长度为2128 bp,编码572个氨基酸,与其他植物的序列高度同源。     

At3g13600截短型蛋白的原核表达载体的构建

拟南芥基因At3g13600编码一种钙调素结合蛋白,序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 818 bp,编码一个具有606个氨基酸残基的多肽,推测分子量为68.9 kD;在At3g13600蛋白的N端存在IQ钙调素结合构象.为了从实验上进一步研究该蛋白的钙调素结合特性,通过逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR)扩增含...     

鳜鱼(S.Keneri)肌球蛋白重链基因cDNA的克隆及其特征分析

鳜鱼(S.Keneri)以优良肉质性状成为极具商品价值和大力推广人工养殖名贵鱼类之一.为掌握控制优良肉质性状的遗传基础,采用同源克隆RT-PCR方法,克隆出该鱼肌球蛋白重链(MYH)cDNA序列.该基因cDNA序列全长5938bp,编码区长度为5814bp,含有poly(A)信号,3’非翻译区长124bp,其开放阅读框共编码1938个氨基酸,推算蛋白质分子质量为221.6Ku.鳜MYH基因由3个结构域组成,即MYSc-type-Ⅱ,SMC-N和Myosintail 1,其中MYSc-type-Ⅱ头部结构与鲤、斑马鱼同源性达90%,具高度保守性.通过DNAstar软件MegAlign构建进化树显示不同物种间该基因核苷酸编码序列同源性为77%—86%,氨基酸编码序列同源性达80%—92%.采用RT-PCR方法研究MYH在不同发育阶段差异表达结果表明,MYH在肌肉效应期开始有低量表达,成鱼期和鱼苗期表达量高,而囊胚期与神经胚均未表达.由此推测MYH基因于肌肉效应期开始表达.研究结果揭示鳜鱼肌球蛋白重链基因在进化上保持与其他脊椎动物相似性和差异性,为决定名贵鱼类肉质结构基因的研究提供了分子生物学基础.     

鳜鱼（S．Keneri）肌球蛋白重链基因cDNA的克隆及其特征分析

鳜鱼（S．Keneri）以优良肉质性状成为极具商品价值和大力推广人工养殖名贵鱼类之一．为掌握控制优良肉质性状的遗传基础,采用同源克隆RT-PCR方法,克隆出该鱼肌球蛋白重链（MYH）cDNA序列．该基因cDNA序列全长5938bp,编码区长度为5814bp,含有poly（A）信号,3’非翻译区长124bp,其开放阅读框共编码1938个氨基酸,推算蛋白质分子质量为221．6Ku．鳜MYH基因由3个结构域组成,即MYSc-type-Ⅱ,SMC-N和Myosintail1,其中MYSc-type-Ⅱ头部结构与鲤、斑马鱼同源性达90％,具高度保守性．通过DNAstar软件MegAlign构建进化树显示不同物种间该基因核苷酸编码序列同源性为77％86％,氨基酸编码序列同源性达80％-92％．采用RT-PCR方法研究MYH在不同发育阶段差异表达结果表明,MYH在肌肉效应期开始有低量表达,成鱼期和鱼苗期表达量高,而囊胚期与神经胚均未表达．由此推测MYH基因于肌肉效应期开始表达．研究结果揭示鳜鱼肌球蛋白重链基因在进化上保持与其他脊椎动物相似性和差异性,为决定名贵鱼类肉质结构基因的研究提供了分子生物学基础．     

翘嘴鳜USP7基因cDNA的克隆及饥饿对其表达影响分析

为探讨饥饿对翘嘴鳜肝脏USP7基因表达的影响,本文应用实时荧光定量PCR、3′-RACE和5′-RACE技术,从翘嘴鳜肝脏组织中克隆得到了USP7基因的全长cDNA序列(登录号:MF000683)为4 319bp。生物信息学分析表明:翘嘴鳜USP7基因编码区全长为3 336bp,共编码个1 111氨基酸,其中180个带负电荷,137个带正电荷。翘嘴鳜USP7在饥饿中的表达分析表明,肝脏USP7基因在不同饥饿时间的相对表达量呈现一个峰值变化,在饥饿4d时出现显著的上升且到达最高值;在饥饿7d时又逐渐下降,最终达到初始水平(P0.05)。本文结果发现饥饿后肝脏中USP7表达量的变化可能与翘嘴鳜的生长和健康状况密切相关,为鳜鱼的生产养殖提供一定的理论依据。     

大黄鱼凝血酶原类似基因的克隆及其表达分析

采用快速末端cDNA扩增法,首次从大黄鱼中克隆到全长为2 023 bp的凝血酶原类似基因cDNA,编码为617个氨基酸,其中包括80 bp的5′末端非编码区及89 bp包含poly(A)尾的3′末端非编码区。预测1~15位的氨基酸处存在1个信号肽。推导的氨基酸序列与哺乳动物及其他鱼类进行同源性比较,发现其与红鳍东方鲀有73%同源性,而与哺乳动物的同源性为50%~65%。凝血酶原类似基因虽然在大黄鱼的各个组织中组成型表达,但是在减毒鳗弧菌免疫的大黄鱼的脾脏和肾脏中表达明显上调,这表明凝血酶可能参与大黄鱼对细菌侵染的免疫应答。     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

眼斑拟石首鱼肽聚糖识别蛋白2的基因克隆与组织表达特性

采用同源克隆技术获得了眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)的肽聚糖识别蛋白2基因(命名为So-pglyrp2).So-pglyrp2的cDNA全长1 729 bp,含有1个1 446 bp的开放阅读框,编码的482 aa前体蛋白带有1个21 aa信号肽;So-pglyrp2基因由4个外显子和3个内含子构成.序列比对分析表明,So-pglyrp2存在1个保守的PGRP结构域,其氨基酸序列与已报道的脊椎动物pglyrp2的同源性最高,一致性为57.1%~82.8%.RT-PCR分析表明,So-pglyrp2基因在肝脏强烈表达,在性腺、肠和胃组织弱表达,在其他组织不表达.研究结果为阐明鱼类pglyrp2基因结构、了解低等脊椎动物pglyrp2的进化地位、探讨鱼类pglyrp2的免疫学功能奠定了坚实的基础.