纤维素降解混合培养物的16S rRNA基因序列分析

以牦牛瘤胃内容物为接种物,以滤纸为唯一碳源富集到一个降解纤维素的混合培养物.构建混合培养物的16S rRNA基因文库,共获得49个序列,分为7个OTU.其中19个序列与已培养细菌的16S rRNA基因相似性97%,占总序列的38.8%;2个古菌的序列与甲烷菌的16S rRNA基因相似性分别为99%和98%,占总序列的4.1%;28个序列属于未培养细菌,占总序列的57.1%.未培养的序列形成4个独立的系统发育分支,其中3个未培养分支与在其他环境中的黏附在纤维素上的瘤胃细菌的16S rRNA基因序列相似性97%,推测这3类微生物可能与纤维素降解相关.     

应用16S rRNA基因序列分析青海放牧牦牛瘤胃细菌多样性

以青海省海北藏族自治州刚察县全放牧牦牛瘤胃内容物为样本,使用细菌通用引物进行瘤胃细菌16S rRNA基因序列的扩增,以16S rRNA序列分析技术分析牦牛瘤胃细菌多样性,并构建16S rRNA基因克隆文库。结果表明:获得114个非嵌合体序列属于93个OTUs(相似性≥97%作为一个OTUs),其中64个OTUs与已知16S rRNA序列相似性≥97%,占总代表序列的68.82%;有27个OTUs与已知16S rRNA序列相似性处于90%~96%,占总代表序列的29.03%;有2个OTUs与已知16S rRNA序列相似性90%,占总代表序列的2.15%。这93个OTUs序列已向Genebank提交,序列号为(KP455685~KP455713,KP765451~KP765514)。将93个OTUs代表序列与已知序列构建系统发育树的分析表明,青海放牧牦牛瘤胃细菌主要分为LGCGPB(the low G+C Gram positive bacteria)和CFB(the Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides group)两大类;而瘤胃内纤维降解菌主要属于LGCGPB这一类。同时在瘤胃内容物中还检测到了14株已培养瘤胃细菌,其中6株属于纤维降解菌,说明了全放牧条件下牦牛瘤胃内纤维降解菌的优势地位。     

应用16S rRNA基因序列技术分析青海高原放牧牦牛瘤胃产甲烷菌的多样性

为了研究高原放牧牦牛瘤胃甲烷菌多样性,为甲烷减排技术提供基础依据。选取体况相近健康的青海高原放牧成年牦牛作为试验动物,采用液氮研磨+改进的CTAB法分别提取瘤胃食糜和瘤胃液总DNA,以产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R扩增16S r RNA基因,分别构建16S r RNA基因克隆文库,分析青海高原地区放牧牦牛瘤胃产甲烷菌的多样性。结果表明:瘤胃食糜、瘤胃液两个克隆文库共200个序列。126个序列(瘤胃食糜68个、瘤胃液58个)属于甲烷短杆菌属,占总序列的63%,8个序列(瘤胃液)属于甲烷杆菌属,占总序列的4%,12个序列(瘤胃食糜7个、瘤胃液5个)属于甲烷球菌属,占总序列的6%,1个序列(瘤胃液)属于Archaeon,占总序列的0.5%,其余53个序列(瘤胃食糜25个、瘤胃液28个)属于未分离鉴定的古菌,占总序列的26.5%;在200个序列中,70.5%的序列与已知的产甲烷菌的相似性≥97%;3%序列与已知的产甲烷菌的相似性在92%~96%,剩余的26.5%序列为未分离鉴定的古菌序列。同时发现,瘤胃食糜以Methanobrevibacter ruminantium strain Yak M3为优势序列,瘤胃液以Methanobrevibacter sp.1Y为优势序列,且在瘤胃液中还检测出7个序列属于Methanobrevibacter millerae,8个序列属于Methanobacterium flexile。系统进化分析表明,这些序列属于Methanobrevibacter,Methanobacterium,Methanosphaera和Archaeon等4个分支。青海高原草地放牧牦牛瘤胃的产甲烷菌以Methanobrevibacter为优势菌群,且产甲烷菌菌群组成在瘤胃固液相中存在一定差异。     

云台山白云岩表层土可培养细菌多样性

运用纯培养法和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析贵州云台山白云岩表层土可培养细菌的多样性.稀释涂布平板分离共获得131株细菌,限制性内切酶HhaⅠ和HaeⅢ对扩增的16S rRNA基因片段进行酶切分型,根据ARDRA酶切图谱划分为40个操作分类单元.16S rRNA基因序列测定和系统发育分析结果显示,这些菌株隶属于包括厚壁菌门(Firmicutes,64.89%)、β-变形菌纲(β-Proterbacteria,3.82%)、γ-变形菌纲(γ-Proterbacteria,17.56%)、放线细菌门(Actinobacteria,11.45%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,3.82%)等5大类群,共13个属.优势菌群为芽胞杆菌属(Bacillus,53.44%),亚优势菌群为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas,9.16%)、假单胞菌属(Pseudomonas,8.40%)和微小杆菌属(Exiguobacterium,8.40%).15.00%的有效序列与GeneBank已知序列相似性小于等于97%,可能为潜在新类群.研究表明,云台山白云岩喀斯特地区不仅含有较为丰富的细菌物种多样性,且潜藏着许多新的微生物资源.     

16S rRNA测序在细菌鉴定中的应用

对分离获得的一株细菌P29,经聚合酶链式反应扩增后测定该菌株的16S rRNA基因序列,由16S rRNA基因序列比较可知,菌株P29与肠杆菌属和泛菌属亲缘关系最为接近,16S rRNA基因相似性达到99%.结合生理生化实验结果综合分析后,将其鉴定为泛菌属的成团泛菌.     

四川传统烟区烤烟叶面可培养细菌的遗传多样性分析

为认识烤烟(Flue-cured tobaccos)叶面可培养细菌的多样性,挖掘叶面可培养细菌资源.本研究以四川省各传统烟区旺长期烤烟叶片为材料,通过纯培养法及测定菌株的产吲哚乙酸(IAA)能力、溶磷溶钾特性、纤维素降解活性、拮抗病原菌等,并通过反转录重复因子扩增(BOXA1R-PCR)技术、16S rRNA基因测序和系统发育分析研究叶面可培养细菌的遗传多样性和功能特征.结果表明:分离得到的86株叶面细菌中有12株菌株(占总分离菌株的13.95%)具有产IAA的能力,4株产量较高(57μg/mL);有9株(占总分离菌株的10.47%)表现溶磷活性,8株(占总分离菌株的9.30%)表现溶钾活性.基于BOXA1R-PCR图谱选取12株代表菌株进行16S rRNA基因序列测定,系统发育分析显示,86株菌株分别属于节杆菌属(Arthrobacter)、短小芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)和假单胞菌属(Pseudomona),其中以假单胞菌属(Pseudomonas)为优势菌属.表明四川传统烟区烤烟叶面存在着丰富的细菌资源.     

对虾养殖池沉积物细菌的遗传多样性

为了解对虾养殖池沉积物中细菌的遗传多样性,采用细菌通用引物构建了细菌16S rRNA基因克隆文库,并从文库中随机挑选克隆子测序,得到37条有效序列,进行序列同源性分析和系统进化分析.结果表明：对虾养殖池底泥中细菌的遗传多样性非常丰富.主要分为六大类群：其中γ-变形菌纲细菌占据优势地位,约占所分析克隆子数的41% 其次是α-变形菌纲和δ-变形菌纲细菌,分别占19% 还有少量的酸杆菌纲、放线菌门和厚壁菌门细菌,分别占所分析克隆子数的3%-8%.所得克隆子序列大都与GenBank库中来自土壤环境中的未培养克隆子序列相似,并且大部分序列的相似性值小于95%,说明对虾养殖池中的细菌大都是未培养的未知细菌,特异地存在于土壤环境中.     

中国南海南沙海区沉积物中细菌16SrDNA多样性的初步研究

通过构建并分析中国南海南沙海区沉积物中细菌16S rRNA基因文库,对其遗传多样性进行了研究.发现沉积物中细菌16S rRNA基因主要来自变形细菌(Proteobacteria)的δ-,γ-,α-亚族和浮霉状菌目(Planctomycetales)等类群,所获的16S rRNA基因的序列与GenBank中已知的细菌16S rDNA序列差异较大,这一结果表明在中国南沙海区沉积物中存在丰富的微生物多样性,并潜藏着特有的微生物资源.     

一株分解纤维素的肠球菌的分离鉴定

从绵羊瘤胃内容物中分离出一株高效纤维素降解细菌.经形态学、生理生化反应和基因型的鉴定,鉴定为肠球菌属的一个种,其16S rDNA序列(1480 bp)在NCBI中的登录号为EU106047,并将所测得的序列用Clustal W软件按Neighbor-Joining方法构建了16S rDNA系统发育树.     

16S rRNA序列分析在多杀巴斯德氏菌鉴定中的应用

目的应用16s rRNA序列分析方法,对多杀巴斯德氏菌进行鉴定。方法采集猝死家兔样本,进行病理组织学检查和病原菌分离培养。针对细菌16S rRNA基因保守区序列设计一对引物,以分离菌株抽提的DNA为模板,进行PCR扩增及16S rRNA序列分析。结果从死亡家兔肺脏中分离鉴定出了一株多杀巴斯德氏菌(PMr0901)。将分离菌株序列与GenBank中收录的序列进行比较,BLAST分析结果显示PMr0901与多杀巴斯德氏菌参考菌株PM70的16S rRNA核苷酸同源性大于99%。分离菌株对阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、左氧沙星、四环素敏感,而对青霉素G已产生耐药性。结论16s rRNA序列分析的分子生物学方法可用于病原菌的鉴定。     

青岛近海浒苔粘附着细菌16S rDNA系统发育学研究

以青岛海域爆发中后期的浒苔(Enteromorpha prolifera)表面粘附着细菌为材料,采用16S rRNA基因序列分析手段研究其系统发育的多样性状况,旨在为深入探索浒苔衰亡的生物机制提供理论依据.研究结果表明:分离的18株浒苔粘附着细菌共分布在8科、10属之中.其中有7株菌分布于α-proteobacteria的2科、4属中;7株菌分布于γ-proteobacteria中的3科、3属中;4株菌分布在Flavobacteriaceae、Microbacteriaceae和Bacillaceae的3个属当中.另外,QDHT-1、QDHT-5、QDHT-7、QDHT-13这4个菌株因其16S序列相似性与属内已知种相比低于97%,预示着可能为新种.结果表明青岛海域浒苔爆发中后期其表面粘附着细菌具有比较大的多样性.     

实时荧光定量PCR技术检测牙周炎致病菌中16S rRNA DNA探针的制备

利用实时荧光定量PCR和细菌16S rRNA测定技术制备牙龈卟啉菌染色体探针,并进行检测,为进一步研究牙周病可疑致病菌提供方法.主要方法是:厌氧环境下培养牙龈卟啉菌,抽提细菌DNA;根据基因库已知牙龈卟啉菌16S rRNA DNA序列,设计特异性的TaqMan探针和一对引物;经实时荧光定量PCR仪进行细菌DNA样本的PCR反应获得反应曲线.结果表明,细菌DNA样本经PCR反应后,在15个循环时,开始出现扩增曲线,此后荧光逐渐增强,在26个循环后达峰值.由此可见,利用细菌16S rRNA技术制备致病菌染色体探针,经实时荧光定量PCR测定,可以对目标微生物进行准确定性和定量.     

胜利油田纯梁采油厂某区块油藏中微生物菌群分析

构建细菌16S rDNA基因文库以及硫酸盐还原菌的dsrAB基因文库,研究了胜利油田纯梁采油厂35区块某油井采出水中微生物的多样性以及SRB的菌群结构组成.结果表明,样品中微生物的多样性指数不高,样品中的微生物主要来自β变形菌纲以及γ变形菌纲,SRB主要由Thermodes-ulfobacterium、Desulfomicrobium、Thermodesulforhabdus以及Archaeoglobus fulgidus等属的微生物组成.将序列相似性≥97%作为一个OTU的划分原则,16S rDNA文库中有2个优势OTU,分别与Arco-bacter以及Pseudomonas stutzeri相近,分别占总克隆数的44%和56%;dsrAB基因文库有3个优势OTU,分别与Archaeoglobus fulgidus、Archaeoglobus infectus、Desulfotomaculum geothermicum相近,分别占总克隆数的46.6%、16.6%以及13.3%.16S rDNA基因序列与已知序列相似性较高,优势菌种在国内油田中较为常见,但不同油藏之间菌群结构存在较大差异.dsrAB序列与已知序列的相似性较小,可能存在新的SRB.     

一株耐高温纤维素降解菌的分离筛选及鉴定

为了分离筛选耐高温的纤维素高效降解菌,从鸡粪蘑菇渣高温堆肥中取样,采用滤纸富集培养基进行富集培养、刚果红纤维素培养基进行分离纯化培养、滤纸条培养基和刚果红纤维素培养基进行初筛培养、液体发酵测定纤维素酶活法进行复筛培养,利用形态特征观察、生理生化特征检测和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析法进行初步鉴定,结果分离筛选到1株耐高温纤维素降解菌XD-3.该菌株在50 ℃生长良好、羧甲基纤维素酶(CMCase)活力达6.14±0.37 U/mL.综合形态特征、生理生化特性、基于16S rRNA基因序列的系统发育分析,菌株XD-3初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）.     

降解除草剂阿特拉津的细菌聚生体的分离和鉴定

将阿特拉津降解速度快但降解不完全的混合菌群与阿特拉津降解完全但降解速度慢的Pseudomonas sp.ADP菌株混合,经过长期驯化培养,筛选到一个能完全降解阿特拉津而且降解速度快的细菌聚生体(bacterial consortium).聚生体含有两个菌株,其中一个菌株来自混合菌群,命名为AD25,另一个是ADP的突变株,命名为Pseudomonas sp.ADP-V.通过16S rRNA基因测序,AD25被鉴定为节杆菌(Arthrobacter sp.).PCR分析和降解实验表明,AD25含有trzN-atzBC基因,能将阿特拉津降解成氰尿酸;ADP-V含有atzDEF基因,是ADP菌株丢失atzABC基因以后的衍生菌,能使氰尿酸进一步降解.由AD25和ADP-V组成的细菌聚生体能快速和完全降解阿特拉津.ADP-V的atzD基因表达和酶动力学实验表明,由于它编码的氰尿酸水解酶(AtzD)的339位蛋氨酸(Met)突变为苏氨酸(Thr),导致酶活力降低从而引起在生长培养基中出现少量氰尿酸积累.     

三株乌梁素海水体细菌的分离与鉴定

采用R_2A培养基,从富营养化的乌梁素海水样中分离到三株细菌,并对其进行了形态特征分析和16S rDNA序列分析。结果表明菌株JR-2在细菌系统学上与迪茨氏菌属(Dietzia)同源性最高,相似性为99%。菌株JR-6在细菌系统学上与氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)相似性为99%。菌株JR-10在细菌系统学上与紫杆菌属(Porphyrobacter)同源性最高,与模式菌株对比,其序列相似性为97%,通常认为相似性低于97%的细菌有可能属于新属。根据以上信息,确定菌株JR-2和JR-6分别是迪茨氏菌属和氢噬胞菌属的成员,而菌株JR-10是否属于新属,还需进一步研究。     

16S rRNA基因的PCR-DGGE技术分析茶尺蠖幼虫肠道细菌种群结构及多样性

利用16S rRNA的PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）技术分析研究了茶尺蠖肠道内细菌的种类与多样性.通过对16S rRNA序列分析,从茶尺蠖野外种群肠适中鉴定了11种细菌,这些细菌分属于沃尔巴克氏菌（Wolbachia）、肠杆菌属（Enterobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）、梭菌属（Clostridium）、肠球菌属（Enterococcus）、暂定类群EO1;其中以肠杆菌、沃尔巴克氏菌、沙雷氏菌属最为常见.另外,也鉴定了一种茶树叶绿体上的16SrRNA基因.茶尺蠖幼虫体内的共生菌多样性分析结果,将会为害虫综合治理提供一条全新的探索途径.     

厦门市区10月份大气气溶胶中细菌群落结构的初步研究

为了全面准确地研究厦门大气气溶胶的细菌群落构成,使用不依赖于培养的分子生态学手段对厦门市区10月份大气气溶胶中的细菌群落结构多样性进行了分析.通过气溶胶采样器在10月份3次收集了气溶胶样品,利用膜DNA提取试剂盒能够较有效地提取到气溶胶中的环境DNA,并且所提取的DNA能够用于后续的PCR扩增及细菌16S rRNA基因克隆文库的构建.克隆文库中的100个克隆子分别分布在3个细菌类群中,分别是:壁厚菌门(Firmicutes),β及γ变形细菌门(Proteobacteria).其中厚壁菌门的克隆子占71%,β变形细菌门占28%,γ变形细菌门占1%.细菌气溶胶的优势菌为Solibacillus属、微小杆菌属(Exiguobacterium)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia).在所构建的克隆文库中,发现有部分的克隆子的序列与致病菌或机会致病菌的16S rRNA基因的序列相似,包括引起医院血液感染的细菌不动杆菌属(Acinetobacter)和皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii),坏疽性口炎及口腔溃疡病原菌(Caryophanon sp.)等.为长期全面监测厦门市微生物气溶胶的组成与变化以及评估空气中微生物对人类健康的潜在影响提供了重要信息.     

16S rDNA序列技术分析鉴定颗粒污泥中的微生物

采用16S rDNA序列分析技术对降解五氯酚的微氧颗粒污泥形成过程中真细菌和古细菌的种群多样性和动态变化进行了研究.通过对DGGE主要条带进行序列比对,发现颗粒污泥中真细菌和古细菌都与不可培养的微生物具有很高的相似性,微氧颗粒污泥中同时存在好氧菌、微氧菌和厌氧菌.通过比较不同菌的相对数量变化发现五氯酚驯化后的颗粒污泥中产生了一系列对五氯酚降解有利的优势细菌和古菌,如Proteobacteria、Sphingomonas、Methanogenic bacterium等.     

德夯嗜盐耐盐菌抗菌活性筛选和系统发育

以8个敏感菌株作为指示菌,采用琼脂扩散法,对分离自湖南省德夯峡谷(28°15′~28°43′ N,109°30′~109°45′ E)普通非盐环境土壤样品中的294株嗜盐及耐盐细菌进行抗菌活性筛选,并对其中具有较强抗菌活性的菌株进行基于16S rRNA基因序列的系统发育分析.受试菌株中有109株的发酵产物具有抗菌活性（阳性率37.1%）,其中5个菌株具有较强抗菌活性（JSM 102030,JSM 102052,JSM 102054,JSM 102066,JSM 102082）.基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,这5个菌株分别属于细菌域(Eubacteria)的3个门(Actinobacteria,Firmicutes,Proteobacteria)中的3个科(Bacillaceae,Halomonadaceae,Nocardiopsaceae)的4个属,菌株JSM 102030属于Halobacillus属,与该属已知种Halobacillus trueperi DSM 10404T的系统发育关系最为密切（序列相似性为99.1%）,JSM 102052和JSM 102054属于Halomonas属,与Halomonas alkaliphila 18bAGT的系统发育关系最为密切(序列相似性为98.3%),JSM 102066属于Nocardiopsis属,与其系统发育关系最为密切的是Nocardiopsis prasina DSM43845T (序列相似性为99.3%),JSM 102082与Oceanobacillus属的Oceanobacillus kimchii X50T以99.6%的16S rRNA基因序列相似性聚在一起.研究结果表明,分离自湖南省德夯峡谷普通非盐环境土样的嗜盐及耐盐细菌中存在较高比例的抗菌活性菌株,且这些细菌具有较为丰富的系统发育多样性.