利用RNA干扰沉默马尔尼菲青霉菌聚酮合酶基因的相关研究

在实验室前期建立的马尔尼菲青霉菌cDNA文库中筛到了1个马尔尼菲青霉菌聚酮合酶基因cps(Cit-rinin Polyketide Synthase),为了研究这个cps基因的功能,构建了RNAi表达盒,表达盒内具有目的基因编码序列422 bp的反向重复序列并被gus基因隔开.整个干扰载体借助根癌农杆菌体系成功转化马尔尼菲青霉菌,并受木糖的诱导启动子xy/p调控RNA干扰.研究发现cps基因沉默的转化子产生与母代红色菌株不同的白色菌株,类似基因敲除的表型,表明cps基因与该青霉菌色素的形成直接相关.     

马尔尼菲青霉菌药靶基因发掘与利用

随着免疫抑制剂、深度化疗、广谱抗生素等的广泛应用,真菌感染尤其是条件致病真菌感染在艾滋病、恶性肿瘤等病人中发病率日趋升高,成为艾滋病、恶性肿瘤等患者的主要致死因素。其中马尔尼菲青霉菌感染已被公议是艾滋病指征之一。本文论述了马尔尼菲青霉菌药靶基因发掘与利用。     

番茄红素β环化酶基因RNAi植物表达载体的构建及遗传转化

番茄红素是类胡萝卜素合成途径中重要的中间产物,本研究探讨了在番茄中通过RNAi手段提高番茄红素含量的依据,由Genbank中番茄红素β环化酶(Lyc-β)序列设计2对引物,通过高保真PCR扩增出2段Lyc-β基因的高度保守片段。根据RNAi的原理将该基因片段构建成为具有RNA干扰作用的植物表达载体,将该干扰载体通过农杆菌介导转化的叶盘法转入烟草中。经过PCR鉴定证明,干扰载体已经转入烟草中。     

扩展青霉菌实时定量PCR内参基因挖掘与应用

实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术因其高效且便捷的特点在基因表达检测中被广泛应用。实时定量PCR结果数据处理策略之一是使用内参基因进行基因表达数据的标准化。文章基于扩展青霉菌孢子不同生长阶段的RNA-seq数据，挖掘和注释了694个稳定表达的候选内参基因；随机挑选出Knr4、Isy1、Spt5、Nucb、Hp1、Hp2、Whth、Hp3、Gph3、Pwi、Taf4、Hp4、Asy、GTPase在内的14个基因，以4、25℃条件下PDB培养基生长6、12、24、36 h的扩展青霉菌为材料，进行实时定量PCR实验。实时定量PCR数据基于geNorm和NormFinder 2种软件的综合分析，表明Isy1、Spt5、Nucb、Hp1适合作为内参基因。以Isy1和Spt5分别作为内参基因，检测Gh30基因在4、25℃条件下扩展青霉菌生长发育过程中的基因表达，显示出一致的基因表达水平，进一步验证了挖掘得到的内参基因的可靠性。该研究为扩展青霉菌的分子生物学研究提供了优良的内参基因，同时提供了一种高效的内参基因的挖掘和鉴定方法。     

马尔尼菲青霉环腺苷酸依赖性蛋白激酶基因的功能研究

从本实验室早期建立的马尔尼菲青霉cDNA文库中,筛选到了一个编码环腺苷酸依赖性蛋白激酶(cAMP dependent protein kinase)基因cdpk.为了研究这个基因的功能,构建了相应的RNA干扰表达盒(利用gus基因将cdpk基因313 bp的反向重复序列片段隔开,并由受木糖诱导的xylP启动子来调控RNA干扰),通过根癌农杆菌介导转化到马尔尼菲青霉中.对转化子的研究发现,cdpk基因的沉默对菌体细胞的形态、孢子的萌发过程无明显影响,但是却减弱了菌落的生长速度、降低了红色色素的产量、并使马尔尼菲青霉几乎丧失了产孢功能.这暗示着cdpk基因对该青霉孢子的形成是必需的.     

人Rab26基因的克隆和表达

以完整EST为参考序列设计引物,以人的胎脑cDNA为模板,用PCR方法筛选获得Rab26基因全长序列,并亚克隆到载体pGEM-T,真核表达载体pEGFP-N1和原核表达载体pET．32a（＋）中,RT-PCR显示该基因在不同组织的肿瘤细胞株中表达量有明显的差异．把Rab26基因转染入HeLa细胞中,通过与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合表达,显示Rab26定位于胞内膜性细胞器上．在大肠杆菌表达系统获得Rab26基因的高表达．这些结果为进一步研究Rab26基因在细胞内吞和运输功能等方面打下了基础．     

靶向survivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.     

烟草MnSoD cDNA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

烟草锰超氧化物歧化酶(MnSOD)是一种由核基因编码并定位于线粒体的蛋白质,是植物体内清除超氧根阴离子的主要酶类．采用RT—PCR方法,从烟草(Nicotiana tubaccum)中克隆到MnSODeDNA基因(SodA),序列分析结果与文献报告的资料相比,核苷酸序列的同源性为99．9％,氨基酸序列的同源性为99．6％．该基因能在原核表达载体pBV221中正确表达,并表现出SOD酶活性．     

RNA干扰降低烟草植株中内源生长素水平

PCR扩增利用吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH)全长序列,构建iaaH基因序列正、反向连接的的双元载体,通过农杆菌LBA4404介导,转化携带pTiC58 T-DNA的烟草叶片,获得携带正、反向iaaH序列的转基因植株.ELISA分析生长素的结果表明,转基因植物叶片的内源生长素含量明显降低,仅为pTiC58 T-DNA转化植株的56%,说明转基因烟草中发生iaaH基因转录后沉默,为利用该基因序列启动RNA干扰(RNAi),抑制冠瘿瘤病发生提供了实验依据.     

人白介素-2重组基因的T载体和pET28a表达载体的构建

从人单核细胞中提取总RNA,利用RT－PCR方法构建cDNA—mRNA杂交链,然后用人白介素－2基因的特异引物进行PCR,PCR产物回收后与T载体连接,经过转化、质粒酶切、测序等一系列手段对插入情况和序列是否正确进行鉴定．鉴定正确后用另一组带有酶切位点的引物和pfu酶进行PCR,用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切PCR回收片段及pET28a表达载体,二者经过连接、转化、质粒酶切、测序等手段重新鉴定序列是否正确．结果表明,插入列T载体和pET28a载体中的序列为402 bp的不带信号肽的基因片段,此序列和GenBank中公布的IL-2序列相一致,故从人单核细胞中提取mRNA后,利用RT-PCR构建的人IL-2基因序列完全正确,为下一步的工作提供了基础。