分泌性BACE1蛋白在昆虫细胞的表达

为了获得有活性的重组β-secretase并研究其功能,寻找特异性抑制剂,应用RT-PCR技术,从人胚胎脑组织特异性扩增并克隆了人BACE1编码基因的胞外片断(BACE1-454)。测序后与质粒pFastBac连接,得到含BACE1-454基因的重组质粒pFast-BACE1-454。将其转化到含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,用琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增对重组穿梭载体Bacmid-BACE1-454进行鉴定。将Bacmid-BACE1-454经脂质体介导转染Sf9细胞,收获病毒。用重组杆状病毒颗粒感染昆虫细胞,表达蛋白,免疫印迹证实所获蛋白产品具有特异的免疫反应性。     

CUEDC2突变体的构建及在原核和昆虫表达系统中的表达

目的：构建CUEDC2的突变体并在原核和昆虫表达系统中表达验证。方法：根据人cuedc2序列设计引物,以其突变体质粒为模板PCR扩增目的片段,酶切后连接至pET28a原核表达载体以及pFastBac1-Flag-N和pFastBac-HTA昆虫表达系统的表达载体,转化至DH5α后提取质粒,经菌液PCR、测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)及DH10Bac感受态细胞中。原核表达载体在E.coli中表达后用Ni-NTA亲和纯化,SDS-PAGE检测。昆虫表达载体提取杆粒,转染至昆虫细胞Sf9中表达,最后用western 进行鉴定。结果：成功构建了CUEDC2的突变体,并在原核和昆虫表达系统中表达。结论：在原核和昆虫表达系统中,成功表达的CUEDC2突变体蛋白为CUEDC2的结构和功能研究奠定了基础。     

CDK1磷酸化修饰对驱动蛋白Kif18A的ATP酶活性的影响

为了探究真核细胞中蛋白激酶CDK1的磷酸化修饰对驱动蛋白分子Kif18A的ATP酶活性的影响,利用昆虫杆状病毒表达系统,在体外表达并纯化Kif18A模拟磷酸化(EE)和非磷酸化(AA)的突变体蛋白(Kif18A-EE,Kif18A-AA).首先构建驱动蛋白Kif18A的杆状病毒表达载体质粒pFast-Bac-FLAG-Kif18A-AA或EE,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆.随后提取杆状病毒基因组,转染昆虫细胞SF9后得到能够表达FLAG-Kif18A突变体蛋白的杆状病毒.扩增病毒后,对病毒感染SF9细胞表达目的蛋白的条件进行优化,最终通过蛋白纯化得到有活性的Kif18A突变体蛋白,并在体外检测纯化蛋白的ATP酶活性.结果显示,Kif18A-EE蛋白的ATP酶活性低于Kif18A-AA蛋白.这一结果表明,CDK1的磷酸化修饰能够降低驱动蛋白Kif18A的ATP酶活性.     

c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

为构建c-Jun氨基末端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase3,JNK3)的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环(activation-loop,A-loop)结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及p VP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到p VP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTMEL Transfection Reagent转染人胚肾(human emborynic kidney,HEK) 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3 (A-loop)结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功; p VP16-eGFP-MycJNK3 (A-loop)成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。     

人annexin A2基因真核表达的构建及活性

为了构建人Annexin A2基因真核表达载体。通过TRIzol法提取Hela宫颈癌细胞中总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链反应)扩增Annexin A2的基因片段,并成功构建成VR1012-Annexin A2-HA重组质粒。经酶切、测序检测其构建的正确性,将质粒瞬时转染到293T人胚肾细胞,使用免疫荧光和蛋白印迹(Western blot)法检测基因表达,使用流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果表明实验成功构建了具有表达活性的Annexin A2真核表达质粒,为进一步研究Annexin A2的抗凋亡作用奠定了基础。     

人全长Notch1基因的克隆及其在HEK293 T细胞中的表达

目的:克隆人全长Notch1基因,构建人全长Notch1/p CMV6-Entry真核重组质粒并在HEK293 T细胞中进行瞬时表达.方法:采用PCR公知不认方法扩增人全长Notch1基因并克隆到真核表达载体p CMV6-Entry中并用限制性内切酶分析和DNA测序鉴定重组质粒.将该重组质粒转染HEK293 T细胞24h后,通过实时荧光定量PCR(q-PCR)和Western blot检测鉴定人全长Notch1的表达.结果:成功构建了人Notch1/p CMV6-Entry重组真核表达质粒,人全长Notch1基因在mRNA和蛋白水平上的表达显著高于p CMV6-Entry载体对照组和HEK293 T细胞对照组.结论:克隆获得人全长Notch1基因并验证在HEK293 T细胞中表达.     

两种帕金森体外模型的构建及相关研究

为检测a-突触核蛋白(a-Synuclein)在人神经元母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中的表达,构建人野生型(WT)和A53T突变型a-Synuclein质粒(p EGFP-SNCA-WT和p EGFP-SNCA-A53T),经酶切鉴定无误后转染SH-SY5Y细胞,并对转染完成的细胞进行嘌呤霉素筛选,然后通过PCR法扩增转染后SH-SY5Y细胞的a-Synuclein片段,并对其进行测序,检测目的基因,运用Western blot法检测转染后SH-SY5Y细胞中a-Synuclein的表达.酶切鉴定结果表明p EGFP-SNCA-WT和p EGFP-SNCA-A53T质粒构建成功,嘌呤霉素筛选和转基因细胞a-Synuclein片段测序结果显示慢病毒表达载体能成功的整合到SH-SY5Y细胞基因组中,Western blot结果表明,转染后的SH-SY5Y细胞能成功的过表达a-Synuclein.a-Synuclein慢病毒表达载体构建成功,并且SH-SY5Y细胞作为宿主细胞能够表达a-Synuclein.为今后帕金森病(PD)体外模型的建立及帕金森病发病机制的研究奠定了基础.     

一种嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶基因在大肠杆菌中的诱导表达与活性表征

从嗜酸普鲁兰芽孢杆菌基因组中扩增出普鲁兰酶基因Pul A,并将该基因连接到大肠杆菌表达载体p ET-28a中,构建了普鲁兰酶基因的诱导表达载体p ET-28a-Pul A。测序结果表明,普鲁兰酶基因Pul A长度为2766 bp,编码922个氨基酸。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,普鲁兰酶基因Pul A在IPTG诱导下获得表达,产生胞内蛋白。SDS-PAGE测定的分子量约为110 k D。细胞超声破碎液酶活为0.45 U/m L。该酶的最适温度为55℃,最适p H为5.0,金属离子对酶活性影响不显著,具有I型普鲁兰酶特性。此重组普鲁兰酶的酶学性质表明此酶具有独特的耐酸性质,具备一定的工业化应用价值。     

植酸酶在酿酒酵母细胞表面上的展示及其活性测定

提取黑曲霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行RT-PCR扩增出约1.4kb的植酸酶基因,双酶切插入用于酒精酵母表面展示的穿梭质粒载体pYD1,转化大肠杆菌DH5α,提取阳性质粒转化酒精酵母菌株EBY100,诱导表达后每隔12h测定植酸酶酶活,结果测得最佳诱导时间为48h.通过对表达产物的酶学性质研究,发现该表达产物在pH7.0时具有较高植酸酶活性,同时该表达产物的最适温度约为65℃.     

人Bre1A基因对人喉癌Hep-2细胞的生长影响

为了构建携带Flag标签的Bre1A连接酶的真核表达载体,获得2B-Flag-Bre1A融合表达蛋白,检测其对肿瘤细胞生长的影响.采用PCR技术从乳腺文库中扩增出Bre1A基因,并将其正确插入到2B-Flag载体中;将重组质粒与空载体分别转染人喉癌细胞系Hep-2后,Western blot检测表达情况,并进行生长曲线实验.双酶切和测序鉴定表明,2B-FlagBre1A真核表达质粒构建成功;转染Hep-2细胞后成功表达,生长曲线实验结果表明,Bre1A抑制喉癌细胞的生长.本论文成功构建了携带2B-Flag标签的人Bre1A基因真核表达载体,重组载体能在人喉癌细胞系Hep-2中表达,且能抑制该细胞的生长,本实验为进一步研究Bre1A在喉癌中的功能奠定了基础.     

毕赤酵母中人Ⅲ型胶原蛋白α链与病毒羟脯氨酸酶的共表达

将人Ⅲ型胶原α链与一种来源于病毒的4-羟脯氨酸酶在毕赤酵母中共表达,以获得能满足应用需求的羟基化胶原蛋白。分别构建包含酶与胶原基因的重组质粒p PICZBL593和pPIC9K-COL3A1,并将质粒均转入毕赤酵母GS115中以表达这两种蛋白。质粒测序结果表明目的基因成功插入到载体中;实时定量PCR结果显示两种基因均在mRNA水平表达;SDS-PAGE和Western Blot进一步证实两种蛋白在毕赤酵母GS115中的成功表达;氨基酸组成分析和质谱结果证实表达的胶原中含有羟脯氨酸。获得羟基化的胶原蛋白。     

结核分枝杆菌Hsp65-Esat6与hGM-CSF联合DNA疫苗的构建与体外研究

目的:应用分子生物学技术,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以p EGHsp65Esat-6为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,同时从质粒p ORF-h GM-CSF中扩增出基因佐剂h GM-CSF,分别克隆到真核表达载体p IRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并转染Hep G-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.93 kb和0.47kb,测序分析表明克隆的Hsp65-Esat6和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(h GM-CSF)序列与Gen Bank上公布序列完全一致;Western-bolt检测到Hsp65-Esat6融合蛋白相对分子质量(Mr)为75 000 k Da;RT-PCR方法检测出p IGM,p IHsp65GM和p IHsp65-Esat6GM转染组细胞均有h GM-CSF mRNA表达,三组细胞中h GM-CSF基因mRNA的表达量差异无统计学意义(P0.05).ELISA方法检测到p IHsp65-Esat6GM转染组细胞培养上清中h GM-CSF的表达,且与空载体对照组比较差异有统计学意义(P0.01).结论:成功构建和表达了p IHsp65-Esat6GM质粒,为研制优于卡介苗(BCG)的新型抗结核病的DNA疫苗奠定了基础.     

变形杆菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的展示表达及重组酶的特性

在生物转化处理工业中利用细胞表面展示技术表达脂肪酶作为一种全细胞催化形式具有很大优势,因为脂肪酶展示在细胞表面作为一种固定化酶.以超折叠绿色荧光蛋白的羧基端结构域作为锚定区,构建变形杆菌来源的脂肪酶与羧基端结构域的融合基因.将融合基因插入到p ETsf GFP表达载体中,得到表面展示载体p ETsf GFP-Lip A.将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-Blue宿主菌中经自诱导后,利用免疫荧光显微技术和流式细胞仪分析确定脂肪酶成功展示于大肠杆菌细胞表面.重组酶的最高酶活达到7 009 U/g干细胞,最适反应温度和p H分别为为37℃和8.0,表面活性剂Tirton X-100、Co~(2+)和Ni~(2+)能显著提高脂肪酶的酶活,60%丙酮处理该酶18 h后脂肪酶残余酶活性为104%,60%乙醇处理该酶18 h后脂肪酶残余酶活性为117%,表明脂肪酶对有机试剂具有很好的耐受性.以上实验结果表明:细胞表面展示技术表达脂肪酶的最大优点为工业化应用提供了坚实的基础.     

解淀粉芽孢杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达。SDS-PAGE试验表明:该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达。植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L。     

表达鸡传染性支气管炎病毒SD/97/01株S1蛋白的重组杆状病毒的构建

采用BAC－TO－BAC杆状病毒表达载体体系构建了表达鸡传染性支管炎病毒（IBV）呼吸型毒株SD／97／01S1蛋白的重组杆病病毒，含SD／97／01株S1基因原重组质粒p MDSD9701S1用BamHI和SalI双酶切后，回收的片段并克琶杆病病毒转座载体pFASTBACHTa中多角体基因启动子的下游，筛选出重组转座质粒pFASTSD9701S1U并转化大肠杆菌DH10BAC后,获得重组穿梭质粒rBacmidSD9701S1，用重组穿俊质粒DNA转染昆虫Sf9细胞，获得了含SD／97／01S1基因的重组杆状病毒rAcSD9701S1，重组病毒感染Sf9细胞后，用SDS－PAGE、Westernblot和IFA对细胞表达产物进行检测和分析。结果表明：构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达SD／97／01的S1蛋白，该蛋白具有天然蛋白的抗原性。     

MTERF1基因真核表达载体的构建及其在C-33A细胞中的表达研究

采用PCR技术从pGEM-MTERF1重组克隆载体中扩增出人MTERF1基因cDNA的开放阅读框序列,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后,以pcDNA3.1(+)为真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1;通过PCR、双酶切和DNA测序方法对重组子进行鉴定;将重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1转染C-33A细胞,利用免疫印迹法检测MTERF1蛋白的表达。结果显示,重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1经双酶切鉴定和菌落PCR鉴定均获得大小为1 200 bp的目的条带,DNA测序结果表明该序列与GenBank中人MTERF1基因序列完全相同,插入基因的大小和方向正确;免疫印迹结果表明,MTERF1蛋白的表达水平在转染pcDNA3.1(+)-MTERF1的C-33A细胞中表达高于转染pcDNA3.1(+)的C-33A细胞。通过对人MTERF1基因的真核表达载体的构建,为进一步研究人MTERF1基因的功能奠定了基础。     

HPV16 E6基因真核表达载体的构建

本研究目的是构建HPV16 E6真核表达载体,为细胞转染研究E6蛋白和p53Arg或p53Pro蛋白的相互作用以及作用后对细胞功能的影响奠定基础。应用PCR技术从质粒pSP64-HPV16 E6上扩增出HPV16 E6片断。根据Kozak序列对真核蛋白表达的影响,设计2条引物扩增出2个HPV16 E6目的片断均插入真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A中,构建pcDNA3．1／myc-His（-）A．HPV16 E6重组质粒。研究结果显示：经酶切和测序鉴定克隆的基因片段为HPV16 E6 cDNA;建立了pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6重组质粒。这表明,已成功构建HPV16 E6真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6。     

毛囊特异表达载体pCDsR-UI的构建以及绒山羊胎儿成纤维细胞的体外转染和筛选

构建IGF1基因的毛囊特异表达载体,可为今后通过体细胞核移植技术建立转基因克隆绒山羊准备核供体细胞.将绵羊IGF1 cDNA序列,连接到含有UHS启动子序列的克隆载体p19TU的SalI、SphI位点,获得过渡质粒载体p19TUI;pCDsRed2和过渡质粒载体分别经酶切和连接构成表达载体pCDsR-UI.以组织块贴附法分离和培养绒山羊胎儿成纤维细胞,外源性表达载体以脂质体方法转染所培养的第2代成纤维细胞,DMEM/F12+ 10％ FBS、37℃5％CO2中培养,经添加G418筛选,获得了稳定表达红色荧光蛋白的细胞克隆,经特异性PCR鉴定证实外源基因已经整合在细胞基因组中.转基因前后分析细胞生长曲线和染色体核型证明转基因细胞的生长状态良好、各项参数正常.     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。     

Sry基因的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pCR3.1-Sry.并检验其在真核细胞内的表达.方法:用PCR法从小鼠基因组中扩增出Sty全长基因,重组入pMD18-T载体,酶切鉴定重组质粒,对酶切正确的重组质粒测序.双酶切测序验证的重组质粒.将切下的片段与真核表达质粒pCR3.1相连构建pCR3.1-Sty重组质粒.将其转染HeLa细胞后,RT-PCR法检测重组质粒在细胞中mRNA的转录;免疫荧光法检测重组质粒在细胞中蛋白质的表达.结果:PCR法扩增得到了1.2 kb的特异性Sry基因片段;成功地构建了真核表达重组质粒pCR3.1-Sry;重组质粒pCR3.1-Sry在HeLa细胞中mRNA及蛋白水平均可检测到表达.结论:重组质粒构建成功并可以在体外真核细胞中表达,为进一步研究其作为核酸疫茁的免疫作用提供了可控的实验材料.