两种胰蛋白酶酶解羊肌肉总蛋白样品的质谱分析

摘要: 目的比较国产和进口两种胰蛋白酶对蛋白质的酶解效果,为后续蛋白质组学稳定研究提供依据。方法用超声破碎法提取羊肌肉组织总蛋白,经两种胰蛋白酶酶解后液相色谱串联质谱检测酶解肽段,将结果上传蛋白质序列数据库,利用质谱分析鉴定方法分析比较两种胰蛋白酶的酶解效果,并借助生物信息学工具对所得数据进行分析。结果两种胰蛋白酶酶解同种蛋白质样品产生的肽段长度86%以上均为6-18 个氨基酸,适用于质谱检测。酶解后肽段产生的质量国产胰蛋白酶优于进口胰蛋白酶,国产胰蛋白酶比进口胰酶酶解可多鉴定到19% 的蛋白质和34%的肽段。结论进口、国产的胰蛋白酶在酶解蛋白质方面均可用于质谱检测前蛋白质的酶解消化。但国产胰蛋白酶价格明显低于进口胰酶,更具应用优势。本研究为评价胰蛋白酶酶解效果提供了一种有效、全面的研究方法。     

两种用于液质联用分析的蛋白质酶解处理效果比较

【目的】分析和评估两种蛋白质溶液酶解方法,为蛋白质组学研究中的大规模质谱鉴定分析建立一种稳定的样品制备技术。【方法】分别使用TEAB法(实验组A)和TFE法(实验组B)对牛血清白蛋白(BSA)进行还原、烷基化和溶液酶解,再用LTQ-Orbitrap高分辨率质谱仪采集BSA酶切肽段信息,比较两种方法得到的数据信息,分析肽段数目、可变修饰位点和蛋白质覆盖率。【结果】实验组A(TEAB法)获得36个肽段、39个修饰位点,蛋白质平均覆盖率为59.31%;实验组B(TFE法)获得27个肽段、27个修饰位点,蛋白质平均覆盖率为47.83%,实验组A的数据指标与实验组B差异显著。【结论】采用TEAB法酶切体系能实现蛋白质高效率酶切,达到获得较高肽段覆盖率的目的,可为蛋白质组学后期的质谱分析鉴定奠定实验基础。     

样品前处理对牛精子全蛋白质组鉴定的影响

本文主要分析样品前处理对牛精子全蛋白质组鉴定的影响,文中对5种不同的蛋白质提取液和3种不同的酶解方法进行了系统地分析比较.5种蛋白质提取液:溶液BS(4%SDS,0.1mol/L Tris-HCl,0.1mol/L DTT);溶液BU(8mol/L Urea,0.1mol/L Tris-HCl);溶液BT(7mol/L Urea,2mol/L Thiourea,0.1mol/L Tris-HCl,0.4%Chaps);溶液BR(购自Thermo,货号89901);溶液BD(2%SDC,50mmol/L NH4HCO3,25mmol/L NaCl).3种酶解方法:溶液内酶解、胶内酶解以及膜上酶解(FASP).实验结果显示:牛精子蛋白质提取能力BS最强,BU最弱;BT、BR以及BD相当.BS-FASP不适用于牛精子蛋白质组学研究.胶内酶解鉴定到的蛋白质均多于FASP法,但是胶内酶解操作过程复杂繁琐,耗时长.基于BD的溶液内酶解法鉴定到的蛋白质数量最多,膜蛋白提取鉴定能力较强,且操作时间最短,是较为理想的方法.     

铜绿假单胞菌SJTD-1的磷酸化蛋白质组学

制备了铜绿假单胞菌SJTD-1菌株的蛋白质组酶解产物,并利用二氧化钛磁珠从酶解产物中富集磷酸化肽.首次利用纳升液相色谱-质谱技术鉴定磷酸化肽的磷酸化位点,最终共鉴定获得13条磷酸化肽,分别来自12个磷酸化蛋白,其中有7个磷酸化蛋白在假单胞菌中是首次发现.分析鉴定到的磷酸化蛋白,发现大多与DNA复制、物质转运、能量代谢等密切相关.这是首次对铜绿假单胞菌SJTD-1菌株进行磷酸化蛋白质组学分析,为SJTD-1在DNA复制、物质和能量代谢以及细胞膜转运等方面的研究奠定基础.     

基于LC-MS/MS策略建立十字花科黑腐病菌蛋白质表达谱的方法研究

【目的】建立十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)的蛋白质组学研究平台,用于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白质。【方法】Xcc 8004经过液体培养,分别提取胞内蛋白质和胞外蛋白质,对所有蛋白质进行液体酶解,通过强阳离子交换色谱预分离多肽混合物,预分离后的馏分采用EASY-nLC结合LTQ-Orbitrap质谱鉴定蛋白质表达谱。【结果】建立了基于bottom-up策略的蛋白质组鉴定方法,采用第一维离子交换预分离和第二维反相色谱分离结合,实现了高通量鉴定蛋白质组表达谱的技术体系。通过SEQUEST检索,在胞内蛋白质样品中共鉴定蛋白质数目为1595个,胞外蛋白质样品共鉴定蛋白质数目为1241个。【结论】建立的LC-MS/MS方法适合用于十字花科黑腐病菌蛋白质组学的研究,为研究微生物植物相互作用奠定了方法与理论基础。     

南方水牛奶酪蛋白及大豆蛋白肽指纹图谱的差异性

通过LTQ Orbitrap XL组合型傅里叶变换高分辨质谱与反相高效液相色谱技术联用建立了南方水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要组分肽质指纹图谱,并对其氨基酸组成与序列进行了比较.结果表明:酪蛋白经胰蛋白酶酶解后得到的28个肽段中没有检测到与酶解大豆分离蛋白181个肽段相匹配的肽段;酪蛋白(CN)的主要组分是αs1-CN、β-CN、κ-CN,大豆蛋白的主要组分为大豆球蛋白(包括大豆球蛋白G1~G5亚基)和β伴大豆球蛋白(α,α',β链);水牛奶酪蛋白和大豆蛋白在亚基组分的氨基酸数量、组成比例和排列方式均呈现出明显的差异,大豆蛋白的各组分亚基的氨基酸全序列均大于酪蛋白各组分的氨基酸全序列,且大豆蛋白各组分的分子质量均显著高于酪蛋白各组分.LTQ Orbitrap XL质谱技术对乳源蛋白肽质指纹的分析,为今后鉴定分析牛奶蛋白中是否添加廉价蛋白提供了高精度和高准确度的检测方法,也为复杂混合物中的痕量组分检测提供了理论依据.     

白斑综合征中国对虾肝胰腺蛋白质组学研究的技术探索

建立白斑综合征中国对虾肝胰腺蛋白质组学技术体系,以患白斑综合征中国对虾的肝胰腺为研究对象,健康中国对虾肝胰腺为对照组,探索2种蛋白质组学差异蛋白的分离和鉴定的方法. 采用双向凝胶电泳(4～7固相pH梯度干胶条,10%SDS-PAGE)分离蛋白质组,银染显色,图像分析软件比较分析,识别差异蛋白,胶上扣点,处理后通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MOLDI-TOF）得到肽质量指纹图谱,软件分析后应用Mascot数据库搜索软件鉴定蛋白. 分别获得中国对虾患白斑病组及对照组正常肝胰腺蛋白质组表达图谱. 分别识别出203和107个蛋白质点. 筛选并尝试鉴定数个差异蛋白. 对各方法步骤进行了技术探讨,对实验过程提出了一系列建议. 建立了双向电泳及生物质谱方法研究中国对虾白斑病的蛋白质组学技术体系. 该体系拓宽了对虾免疫生理研究的途径,以从蛋白质水平探讨对虾发病机制,寻找有效药物靶点.     

蛇毒蛋白质组学研究进展

就蛇毒蛋白质组学研究的主要方法、所取得的成就及存在的问题进行了综述.利用高通量质谱技术对蛇毒组分进行全方位研究,是近年来蛋白组学研究中的一个热点.蛇毒蛋白质组学研究包括粗毒分离、质谱分析及生物信息学鉴定三个部分.粗毒分离的主要方法包括双向电泳、凝胶过滤及反相-高效液相色谱;质谱分析的方法包括基质辅助激光解离-飞行时间质谱、液相色谱质谱联用、电喷雾离子化串联质谱和电喷雾离子化傅立叶变换离子回旋共振质谱;而利用MS-Fit或Mascot搜索引擎访问相应的蛋白质专门网站对质谱所获肽序进行查询则是生物信息学鉴定的主要方法.迄今,利用蛋白质组技术已经对游蛇科、眼镜蛇科、蝰科中的58个属100多种（亚种）蛇毒的毒物进行了研究,鉴定出了十多个蛋白质家族.这些结果不仅有助于增强人们对毒素进化与分化以及中毒机理的了解,并对新药设计中的先导化合物寻找具有重要意义.未来,蛇毒蛋白质组学研究在与高通量蛇毒组的绝对定量及所鉴定蛋白的功能表征有关的方法技术方面仍有待突破.     

基于OFFGEL预分离二维液质联用技术在大鼠海马膜蛋白中的应用

以大鼠海马膜组分为研究对象,以等电聚焦OFFGEL为研究手段,结合反相液相色谱质谱联用技术,考察对酶切肽段的分离富集性能,同时结合DAVID分析工具对分离富集得到的酸性蛋白质进行的GO分析.结果表明,海马膜组分的酶切肽段经过OFFGEL分离后,得到24个不同馏分,每个馏分经过纳流液相色谱-质谱检测,发现有77% 的肽段专属于一个馏分,在酸性范围内的肽段等电点偏差较小,可以达到良好的聚焦效果;酸性蛋白的GO分析结果显示,质膜和物质的跨膜运输所占比例最大.OFFGEL作为一种预分离手段,可以应用于生物样品的大规模蛋白鉴定,在进一步蛋白质层面的生物功能研究中表现出良好的应用前景.     

液相色谱-高分辨串联质谱法检测牛奶中A1和A2 β-酪蛋白

建立一种基于液相色谱\|高分辨串联质谱（LC-HRMS/MS）方法检测牛奶中A1和A2 β-酪蛋白. 采用等电点沉淀法从牛奶中提取酪蛋白, 经胰蛋白酶酶解后, 将酶解产物进行LC-HRMS/MS分析, 选择含有差异氨基酸残基（第67位）的肽段作为特征肽段对A1和A2 β-酪蛋白进行区分. 采用Tris-HCl缓冲溶液充分溶解酪蛋白, 在酶解反应体系中添加乙腈以提高酶解效率. 采用高分辨质谱和串联质谱技术, 进一步排除杂质产生的干扰信号. 采用该方法对市售4种普通牛奶和2种A2牛奶进行检测, 结果表明， 普通牛奶中A1 β-酪蛋白的含量约为A2 β-酪蛋白含量的2~4倍, 个别A2牛奶样品含微量A1 β-酪蛋白. 该方法可检测牛奶中的A1和A2 β-酪蛋白, 具有高可靠性、 高灵敏度等优点, 为A2奶源筛选和质量控制提供支持.     

鹿茸水提取物及其蛋白酶解物对小鼠 脾淋巴细胞增殖的影响

研究了鹿茸水提取物中非蛋白成分、粗蛋白酶解物及分离组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响.非蛋白成分和酶解物的分离分别采用HPLC法和超滤法.应用WST-8法检测各分离组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,采用高分辨质谱对非蛋白成分进行初步鉴定.结果显示,非蛋白成分对未经刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠脾细胞增殖的促进作用优于其分离组分,Fr.Ⅲ和Ⅳ对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖有抑制作用,初步鉴定其为碱基和核苷酸的混合物.分子量大于10 kDa的肽段,单独可刺激小鼠脾细胞增殖,且对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用.肽段分子量大小对其免疫调节活性影响较大,但并未呈现直接的相关性.肽的氨基酸组成、序列及构型等也是影响其活性的重要因素.     

采用比较蛋白质组学方法研究p38β激酶对293T细胞蛋白质表达的影响

采用比较蛋白质组学方法研究了过表达p38信号通路激酶p38β对人类肿瘤细胞293T细胞蛋白质表达的影响,利用双向电泳和质谱技术分离鉴定了13个差异表达蛋白质.这些差异蛋白的分布从细胞质膜到核,其功能涉及核酸、蛋白质、糖脂类分子的转录、合成和成熟,细胞物质跨膜运输,细胞周期调控以及细胞防御等.文献分析并没有发现上述鉴定的差异表达蛋白是p38β激酶现有直接底物的证据,提示其可能为新的p38β激酶相关蛋白.这些结果表明,比较蛋白质组学方法是寻找激酶新靶标的一种有效工具.     

人骨骼肌双向电泳条件优化及部分蛋白质鉴定

目的建立和优化人骨骼肌组织双向电泳模型,为深入探讨骨骼肌萎缩的分子机制提供方法上的保障。方法使用两性离子去垢剂CHAPS和SB3-10,并配合不同浓度的离液剂抽提骨骼肌蛋白质,并通过双向电泳对蛋白质进行分离,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)对选取的蛋白质进行鉴定。结果优化过的双向电泳模型可在一张凝胶上分离800多个蛋白质点,通过MALDI-TOF鉴定出HUMANserine/threonine protein kinase KKIALRE等4种低丰度蛋白质。结论多种去垢剂和离液剂的组合使用才能获得对组织中蛋白质较好的抽提效果。获得的人骨骼肌双向电泳图谱是对人类骨骼肌蛋白质组学数据库的有益补充,为使用比较蛋白质组学方法筛选人肌病关键蛋白质提供了实践和理论基础。     

双向电泳和肽质谱技术分析结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞引致的差异表达蛋白

利用双向电泳及质谱技术对感染结核杆菌H37Ra株前后的巨噬细胞U937株的蛋白质组进行分离和比较分析．双向电泳后在分子质量20～200ku，等电点pI3～10范围内分离出1913个不同蛋白质斑点，肉眼可以明显看见4个蛋白质斑点在表达上的差异．对其中分子质量约75ku等电点约9．5的蛋白质斑点酶解后，进行质谱分析，鉴定为分子质量75．4ku、等电点9．52的蛋白DEAD／H Box Polypeptide 18．说明用蛋白质组学研究结核杆菌与巨噬细胞相互作用机理是可行的，所鉴定的蛋白质DEAD／H Box Polypeptide 18可能与巨噬细胞防御系统有关．     

适合杨树叶片蛋白质组学样品制备方法的比较（英文）

【目的】为了提高植物叶片中低丰度蛋白质的检测效率,建立有效的杨树叶片蛋白质组学分析的蛋白质提取方法。【方法】利用三氯乙酸-丙酮结合PEG分级提取方法和SDS-酚结合PEG分级提取方法对杨树叶片蛋白质进行提取,并采用SDS-PAGE和双向凝胶电泳(2-DE)对提取结果进行评价。【结果】SDS-PAGE实验结果显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG方法优于SDS-酚结合PEG分级方法。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级和非结合PEG分级提取蛋白质的双向电泳结果表明,PEG分级能有效地去除高丰度蛋白质Rubisco,提高低丰度蛋白质的检测。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级法检测的蛋白质比非结合PEG分级法多90个蛋白质点。【结论】以LTQ-Orbitrap XL分析三氯乙酸-丙酮结合PEG分级分离的一些蛋白质显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG分级对于2-DE和MS鉴定低丰度蛋白质是一种有效的分离方法。     

适合杨树叶片蛋白质组学样品制备方法的比较

【目的】为了提高植物叶片中低丰度蛋白质的检测效率,建立有效的杨树叶片蛋白质组学分析的蛋白质提取方法。【方法】利用三氯乙酸-丙酮结合PEG分级提取方法和SDS-酚结合PEG分级提取方法对杨树叶片蛋白质进行提取,并采用SDS-PAGE和双向凝胶电泳(2-DE)对提取结果进行评价。【结果】SDS-PAGE实验结果显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG方法优于SDS-酚结合PEG分级方法。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级和非结合PEG分级提取蛋白质的双向电泳结果表明,PEG分级能有效地去除高丰度蛋白质Rubisco,提高低丰度蛋白质的检测。三氯乙酸-丙酮结合PEG分级法检测的蛋白质比非结合PEG分级法多90个蛋白质点。【结论】以LTQ-Orbitrap XL分析三氯乙酸-丙酮结合PEG分级分离的一些蛋白质显示,三氯乙酸-丙酮结合PEG分级对于2-DE和MS鉴定低丰度蛋白质是一种有效的分离方法。     

基于蛋白质组学技术筛查维吾尔族妇女宫颈癌前病变患者血浆蛋白预警标志物

 依托蛋白质二维液相色谱和质谱技术,寻找与新疆维吾尔族妇女宫颈癌癌前病变高度宫颈鳞状上皮内瘤样变(HSIL)相关的血浆预警蛋白标志物,旨在对宫颈癌做到早期预防和诊断。收集维吾尔族HSIL(21例)和宫颈炎(22例)患者血浆标本并制备血浆低丰度蛋白质组样品,通过对蛋白质二维液相色谱系统的分离与鉴别分析,筛选出差异表达的组分,并运用质谱和生物信息学技术进行鉴定和功能识别分析。确定了宫颈炎和HSIL患者的基于蛋白质等电点和疏水性特征的血浆低丰度蛋白质组图谱,筛选出10个差异表达蛋白组分。结果表明,在HSIL患者血浆中3个低丰度蛋白组分含量明显上升,1个组分含量下降;而通过质谱技术鉴定出31种蛋白质,其中4种蛋白质与肿瘤进程密切相关,分别是代谢相关蛋白(APOA1)、信号转导相关蛋白(mTOR、EphA3)和免疫功能相关蛋白(HLA-DQB1)。本文针对维吾尔族妇女这一宫颈癌高发人群,展开癌前病变患者血浆低丰度蛋白组表达水平的研究,鉴定出多种差异表达血浆蛋白预警标志物,为本区宫颈癌的预防和早期鉴别诊断及癌变机制研究提供了依据。     

对B.t毒素敏感与抗性的昆虫细胞的差异蛋白质肽质指纹分析

采用2-DE技术分析了粉纹夜蛾TnH5对B.t CrglAC毒素敏感和抗性2种细胞总蛋白质,建立了TnH5细胞双向电泳图谱,获得了一些差异蛋白质.对部分差异蛋白质点采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)测定了其胶内酶解后的肽质指纹图谱(PMF),查询数据库,结果表明,部分差异斑点分别与胞质外周蛋白、脂多糖生物合成蛋白、一种脱氢酶和类免疫球蛋白等类似.     

采用比较蛋白质组学方法研究p38β激酶对293T细胞蛋白质表达的影响

采用比较蛋白质组学方法研究了过表达p38信号通路激酶p38β对人类肿瘤细胞293T细胞蛋白质表达的影响．利用双向电泳和质谱技术分离鉴定了13个差异表达蛋白质．这些差异蛋白的分布从细胞质膜到核．其功能涉及核酸、蛋白质、糖脂类分子的转录、合成和成熟．细胞物质跨膜运输．细胞周期调控以及细胞防御等．献分析并没有发现上述鉴定的差异表达蛋白是p38β激酶现有直接底物的证据。提示其可能为新的p38β激酶相关蛋白．这些结果表明．比较蛋白质组学方法是寻找激酶新靶标的一种有效工具．     

禁食对小鼠下丘脑磷酸化蛋白质组的影响

本研究旨在通过干预小鼠进食,探讨对小鼠下丘脑中蛋白质磷酸化修饰和相关信号通路的影响,为完善蛋白磷酸化调控网络提供有价值的信息.将实验小鼠平均分为3组,分别为对照组(con)、禁食组(D2)和禁食后恢复组(DR),每组小鼠数量为3只.在48 h内,con组正常提供饲料,D2组不提供饲料,DR组前44 h不提供饲料、后4 h提供饲料.同时解剖3组小鼠并提取下丘脑组织,提取、纯化和酶解下丘脑组织的蛋白质,并采用二氧化钛富集分离技术富集磷酸化肽段,运用高通量液相色谱-质谱联用进行检测,以鉴定样品中的磷酸化蛋白质组.利用非标记定量方法筛选差异表达的磷酸化蛋白以及位点,对鉴定数据进行GO富集和KEGG通路分析,并探究磷酸化蛋白间的相互作用关系.结果显示,共鉴定到4 810个磷酸化蛋白质,对应于14 259个磷酸化位点发生了变化.采用数学统计方法分析,成功确认小鼠下丘脑中有681个磷酸化蛋白差异显著,观察到这些差异蛋白与蛋白结合、激酶行为、转运、轴突生成等分子活动和生物学过程有关,并富集到了MAPK、细胞内噬和环磷酸腺苷信号通路等11个主要的信号通路.这说明禁食会对小鼠下丘脑中多种蛋白质的磷酸化修饰...