基因敲除动物模型的建立

基因敲除是 80年代后半期应用ＤＮＡ同源重组原理发展起来的一门新技术。它是指对一个结构已知但功能未知的基因 ,从分子水平上设计实验 ,将该基因去除 (ｋｎｏｃｋｏｕｔ) ,或用其它顺序相近基因取代 ,然后从整体观察实验动物 ,推测相应基因的功能。80年代初 ,胚胎干细胞分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。 1985年 ,首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础[1] 。 1989年Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等通过基于ＥＳ细胞囊胚注射的基因敲除 ,建立了次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶 (ｈｒｐｔ)基因被定点剔除的小鼠模型[…     

几种常用的基因敲除技术

随着功能基因组学研究的深入发展，基因敲除技术逐渐成为基因功能研究的重要手段，本文就常用的三种基因敲除技术，即同源重组、插入突变、RNA干扰各自的原理、适用的范围和优缺点作简要介绍。     

同源重组敲除三角褐指藻基因的研究

为探索应用基因敲除技术研究三角褐指藻基因功能的研究体系,本文以三角褐指藻甘油激酶基因作为靶基因,构建了同源重组基因敲除载体,利用微弹轰击法将该载体成功转化至三角褐指藻中,经100μg/mL Zeocin筛选和PCR验证获得了34个阳性转基因藻株;并进一步对三角褐指藻甘油激酶基因敲除转基因藻株的甘油激酶表达量和生长两方面进行分析,结果显示胞外甘油兼养不影响转基因藻细胞生长,甘油激酶不表达或表达量降低.本文通过构建敲除载体,完成了遗传转化,筛选获得阳性转基因藻,并进一步研究了转基因藻的性状,最终建立了应用同源重组基因敲除技术靶向研究三角褐指藻基因功能的研究体系.     

大肠杆菌 aroL 基因敲除及其对莽草酸合成的影响

以E.coli DH5α基因组为模板克隆莽草酸激酶Ⅱ基因(aroL),构建质粒pMD-aroL,经HpaⅠ、BsaBⅠ酶切后插入卡那霉素抗性基因(kan)得pMD-aroL::kan,利用pKD46的λ重组系统,用该质粒上的kan及两端的aroL同源序列替换E.coli Top10F′基因组上的aroL基因,再运用质粒pCP20编码的FLP重组酶消除kan基因.Southern blot证实基因敲除是成功的,测序结果表明kan已经从基因组上消除,摇瓶发酵显示构建的基因工程菌的莽草酸产量是原始菌株的1.57倍.     

改造细菌基因组的双重选择系统的构建

对细菌基因的敲除与回补可以用于基因功能的研究和基因组的改造。传统的Red同源重组敲除系统依赖于抗性标记基因的正向选择,无法实现基因回补菌株的选择。文章通过构建具有独特优势的双重选择系统,将2种选择标记基因tetA和sacB构建到一个自杀质粒中,该质粒含有tetA-sacB双基因盒,可以利用该双基因盒的双重选择作用实现细菌基因组中基因的敲除与回补。结果表明：在敲除大肠杆菌MG1655中的lacZ基因时,利用构建的双重选择系统中tetA的抗生素耐药性成功筛选到阳性克隆;利用双重选择系统的反向选择作用,在含有镰刀菌酸和蔗糖的培养基上进行筛选,实现了lacZ基因的回补。     

2007年诺贝尔医学奖青睐小鼠基因改造技术

诺贝尔奖是以瑞典著名化学家、硝化甘油炸药发明人诺贝尔的名字命名的.2007年的诺贝尔医学奖被称为"基因敲除"的奖项,获奖的三位科学家马里奥·卡佩基(Mario R.Capecchi),马丁·埃文斯(Martin J.Evans)和奥利弗·史密斯(Oliver Smithies)从各自不同的研究角度使这项技术成为可能.卡佩奇对于同源重组的研究奠定了基因敲除技术的基础.埃文斯的胚胎干细胞研究对于基因敲除技术具有意义.史密斯的工作使在培养细胞中的基因靶向技术成为可能.基因敲除技术又称为基因靶向技术,其基本方法包括通过同源重组改变基因,利用干细胞得到嵌合体小鼠,胚胎干细胞中进行同源重组,直到诞生基因敲除的小鼠.这项技术为基因治疗以及人类疾病的动物模型研究打下了基础.     

yigP——大肠杆菌生长所必需的基因

yigP基因在大肠杆菌基因组上位于辅酶Q生物合成相关基因ubiE和ubiB之间,3者构成一个操纵子。利用温敏质粒pMAK705系统敲除大肠杆菌基因组上的yigP基因后,发现二次重组子内的温敏质粒无法通过高温培养丢失,即染色体上的yigP基因被敲除后,必须依靠质粒上完整的yigP基因才能存活;通过功能回补yigP基因的表...     

利用Cre-LoxP重组系统构建gdh1基因敲除的酿酒酵母重组菌

基于PCR介导的基因敲除原理,采用Cre-LoxP重组系统技术,对2倍体酿酒酵母的SS04菌株的gdh1基因进行敲除操作,构建gdh1基因完全缺失型的酿酒酵母重组菌SS17菌株,进而为后续重组酵母的乙醇代谢研究打下基础.     

同源重组法敲除酵母snoRNA基因的初步探讨

以3个粟酒裂殖酵母核仁小RNA为对象,通过同源重组法构建相应的基因缺失株,并对影响同源重组效率的因素进行分析.结果显示:载体骨架的切除可以显著提高同源重组效率;增加两侧同源片段的长度也能提高同源重组效率;另外,利用粟酒裂殖酵母野生型单倍体菌株进行snoRNA 基因敲除是可行的.     

MSMEG0372基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌的构建与鉴定

目的 为研究MSMEG＿0372基因的功能,构建该基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.smegmatis)并鉴定。方法 聚合酶链反应(PCR)扩增MSMEG＿0372基因的左、右臂(即等位基因互换底物,allele exchange substrates, AES)。AES与p0004s经过酶切并连接,构建p0004s-AES质粒。p0004s-AES与phAE159经过酶切并连接,构建phAE159-AES噬菌粒。噬菌粒转化至M.smegmatis,30℃培养,扩增重组噬菌体。用重组噬菌体侵染M.smegmatis,37℃培养,发生基因同源重组,形成MSMEG＿0372基因敲除菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。PCR扩增MSMEG＿0372基因,构建pMV361-MSMEG＿0372质粒。将pMV361-MSMEG＿0372质粒分别导入MSMEG＿0372基因敲除菌株和野生型M.smegmatis,构建MSMEG＿0372基因回补菌株和MSMEG＿0372基因过表达菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。结果 PCR扩增出MSMEG＿0372...     

林可霉素转运蛋白基因lmrC的功能分析

为了研究腺苷三磷酸结合盒转运蛋白LmrC是否参与林可霉素的生物合成,通过同源重组在林可霉素高产菌株LC-G中构建了lmrC的缺失突变株XJJ7.高效液相色谱(HPLC)分析和抗性检测显示,相比出发菌株LC-G,XJJ7的林可霉素产量下降了55%,而且耐受林可霉素的最高质量浓度降低了50%.进一步实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析发现,突变株XJJ7中林可霉素生物合成基因lmbA和lmbR的转录明显低于LC-G,但调控基因lmbU的转录不变.在LC-G中lmrC的过表达不能进一步提高产量,也不影响lmbA、lmbR和lmbU基因的转录,但过表达菌株对林可霉素的抗性显著增强.结果表明,lmrC可以通过影响生物合成基因的转录来调节林可霉素的产生,并赋予产生菌一定的抗性.     

p53 基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定

摘要: 目的为了繁育和鉴定p53 基因敲除小鼠,将引进的杂合子小鼠进行饲养繁殖,杂合子用于继续保种。方法 对其幼鼠剪尾提取基因组DNA,采用PCR 方法进行基因型鉴定。结果对引进小鼠已成功饲养和繁殖,并得到 纯合基因缺失型小鼠。结论正确的饲养、繁殖及基因鉴定方法对于基因敲除小鼠的获得和保种具有重要的意 义。     

盐酸林可霉素的萃取与结晶提纯

为了降低盐酸林可霉素粗品中的B组分含量,采用萃取与结晶相结合的方法,分别研究了萃取结晶过程中萃取荆种类、用量、原料浓度、溶液pH等条件以及溶析结晶过程中的混合速率对产品纯度的影响.结果表明:丁醇或氯仿有较高的萃取效率;降低原料浓度或在萃取、反萃时分别保持溶液pH为11和5均有利于提高产品中的A组分含量;结晶过程中提高搅拌速率有利于提高产品纯度.以氯仿为萃取荆,经过单级萃取,结晶后产品中A组分纯度最高可达97.86%.     

小鼠Bpi条件基因打靶载体的构建和鉴定

目的构建小鼠Bpi条件基因打靶载体,为建立Bpi条件基因打靶小鼠模型和深入研究Bpi基因功能奠定基础。方法采用Cre/LoxP系统,选择小鼠Bpi基因第2、3外显子作为条件性敲除的目的片段,并在其两侧插入LoxP位点;运用LA-PCR技术,以129品系小鼠ES细胞基因组DNA为模板分步扩增包括Bpi第2、3外显子(中间同源臂)和上游同源臂在内的3.1 kb基因片段以及下游同源臂4.9 kb基因片段;构建pBSKⅡ-5SLoxP和ploxPFRTNeo-3L重组质粒,将前者酶切产物(3.1 kb)与酶切后的ploxPFRTNeo-3L质粒相连获得Bpi条件基因打靶载体。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的pBSKⅡ-5SLoxP、ploxPFRTNeo-3L重组质粒和Bpi条件基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Bpi条件基因打靶载体。     

Smad3基因剔除小鼠的基因型鉴定与繁殖性能研究

以前的研究显示Smad3基因剔除 (Smad3ex8 ex8)导致小鼠发生渐进性的白细胞增多症、牙周炎、胃炎、肠炎以及粘膜表面附近脓肿形成的慢性感染。对有症状的Smad3ex8 ex8小鼠淋巴结的组织学及免疫表型分析显示T细胞有增强的增殖能力及活化的表型。进一步的研究表明Smad3ex8 ex8小鼠胸腺细胞及外周T细胞彻底失去了对TGF β的应答。此外 ,Smad3ex8 ex8突变纯合子小鼠还表现出典型的骨关节炎、骨质疏松和创伤愈合速度加快表型。因此 ,Smad3ex8 ex8突变纯合子小鼠有可能作为研究粘膜免疫缺陷和骨性关节炎等疾病发生的分子机制的模型动物 ,为了…     

林可霉素和3种大环内酯类抗生素对厌氧消化的影响

林可霉素和3种大环内酯类抗生素(红霉素、螺旋霉素、阿奇霉素)在医疗和畜禽养殖等多个领域应用广泛,并且能够通过制药废水、畜禽废水以及市政污泥的排放和处理等多种途径进入环境。厌氧消化是有效处理抗生素废水的常用方法。从典型废水中抗生素浓度分布和对厌氧消化代谢过程的影响角度出发,总结了厌氧消化对上述抗生素的响应特征。结果表明:林可霉素和3种大环内酯类抗生素在低浓度时促进厌氧消化产甲烷,高浓度时抑制厌氧消化产甲烷,主要通过厌氧消化产甲烷过程中挥发性脂肪酸(VFAs)的累积,以及某些挥发性脂肪酸氧化菌活性和产甲烷古菌活性的降低来抑制厌氧消化产甲烷。最后,探讨了上述抗生素厌氧生物降解的代谢途径和缓解抗生素对厌氧消化抑制的方法。     

含菌丝体林可霉素发酵液的预分散溶剂萃取

以醋酸丁酯为萃取溶剂，采用预分散溶剂萃取法从含菌丝发酵液中直接萃取林可霉素。实验结果表明：由于胶状液沫、胶状气沫和菌丝体的相互作用，被萃取液中适量菌丝体的存在有利于萃取和分层，分层效果好于不含菌丝体的林可霉素水溶液。当发酵液的菌丝体含量控制在15～150g／L时，分层效果较好，油相富集迅速，在实验条件下一次萃取率最高可达78．6％。     

液化液代替液化糖生产林可霉素的研究

考察在基础培养基和补糖中用液化液代替液化糖对 Streptomyces lincolnensis 13生长及林可霉素发酵效价的影响.结果表明:在基础培养基中用液化液代替液化糖,发酵效价提高了8.6;,而在基础培养基和补糖中都用液化液代替液化糖,发酵效价提高了12.4;.液化液在基础培养基和补糖中代替液化糖生产林可霉素是可行的.     

核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化

利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法对核盘菌的交配型基因mat1-1进行基因同源重组的敲除对比实验,获得了缺失mat1-1基因的转化菌株.先利用PCR方法获得mat1-1基因的左右两侧片段,将测序正确的两个侧翼片段分别重组到农杆菌转化载体PBI-G3C中,并将新霉素抗性标记引入农杆菌转化载体PBI-G3C中,构建成农杆菌介导转化核盘菌的打靶载体ΔPBI-G3CN-mat1-1,再将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至根癌农杆菌EHA105中.利用核盘菌菌丝进行转化,将得到的转化菌株,利用PCR方法进行验证,证实有敲除菌株存在.通过对敲除菌株进行生理表型的测定发现,缺失mat1-1基因的敲除菌株其生长速度与野生核盘菌菌株相比无明显差异,但敲除菌株不能产生菌核与子囊盘.     

紫杉醇生物合成途径及其相关酶的研究进展

紫杉醇的生物合成过程已基本阐明,其合成以NB028牛儿基NB028牛儿基二磷酸为前体约需20步酶促反应,近一半的相关酶基因已得到克隆与表达.综述了紫杉醇生物合成及生物合成途径中9个酶基因的克隆和表达方面的研究进展,并指出随着紫杉醇生物合成分子生物学研究的不断深入,利用分子生物技术大规模生产紫杉醇将为期不远.