根癌农杆菌介导的绿色荧光蛋白基因在水稻植株中的表达

将改良的绿色荧光蛋白（EGFP）基因插入到植物表达载体中,构建了ubi启动子驱动下的植物表达载体p13UEGFP．通过根癌农杆菌介导转化水稻的胚性愈伤组织,经潮霉素筛选,获得抗性愈伤组织和再生植株．对T2代植株进行PCR分析、激光共聚焦显微镜检测和RT—PCR分析,结果表明,绿色荧光蛋白基因已经在转基因植株中稳定表达．     

根癌农杆菌介导的异角状拟盘多毛孢菌转化系统研究

以携带潮霉素B磷酸转移酶抗性基因(hph)的pBHt1作为转化载体,根癌农杆菌AGL-1作为转化介体,实施转化异角状拟盘多毛孢菌。研究发现,异角状拟盘多毛孢菌的最优转化体系为:异角状拟盘多毛孢菌分生孢子悬浮液浓度为1×106个/mL,根癌农杆菌OD600为0.3,共培养时间48 h,共培养温度为25℃,诱导培养基中乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L,选择培养基添加250μg/mL潮霉素B、250μg/mL头孢噻肟钠。1×106个异角状拟盘多毛孢菌分生孢子可以产生200～300个转化子,随机挑选10个转化子进行PCR检测,均能扩增出预期条带,且在不含潮霉素B的PDA培养基平板上转化子连续培养5代后,hph基因仍能稳定遗传,这表明T-DNA已经插入到异角状拟盘多毛孢菌的基因组中。此次建立的异角状拟盘多毛孢菌的转化体系可为该病菌的功能基因研究和寄主与病原菌的互作研究提供有效的工具。     

叶片衰老抑制基因PSAG12-ipt转入籼稻不育系中A的研究

以质粒pSG516(ipt)为目的基因, pHQ9(hpt和gus)为选择/标记基因进行共转化,以PSD-1000-氦气基因枪介导,将ipt、hpt和gus基因转化到籼型不育系中A的核DNA中,得到了98个潮霉素抗性再生植株系.经过GUS基因组织化学染色检测、PCR检测以及Southern blot杂交分析,证实了叶片衰老抑制基因PSAG12-ipt已经整合到水稻基因组中.     

H5N1型禽流感病毒HA基因在烟草中的表达

禽流感病毒H5N1是可以直接感染人类的甲型流感病毒,发展植物源口服疫苗是疫苗研究的方向之一.本研究通过农杆菌介导的方法将禽流感病毒H5N1的HA基因转化烟草.共获得38株潮霉素抗性植株,经PCR和Southern-blotting检测,目的基因已整合到转基因植株的基因组中.Western-dotting检测结果表明,目的基因在转基因烟草中得到表达,具有免疫原性,获得了能够表达HA基因的植物口服疫苗候选植株.     

H5N1型禽流感病毒HA基因在烟草中的表达

禽流感病毒H5N1是可以直接感染人类的甲型流感病毒，发展植物源口服疫苗是疫苗研究的方向之一．本研究通过农杆菌介导的方法将禽流感病毒H5N1的HA基因转化烟草．共获得38株潮霉素抗性植株，经PCR和Southern-blotting检测，目的基因已整合到转基因植株的基因组中．Western-dotting检测结果表明，目的基因在转基因烟草中得到表达，具有免疫原性，获得了能够表达HA基因的植物口服疫苗候选植株．     

口蹄疫抗原决定簇融合基因转化胡萝卜的研究

利用转基因植物生产疫苗是目前植物基因工程的一个研究热点,具有生产简单、成本较低、使用安全方便、易贮存等优点.本实验通过农杆菌介导的遗传转化,以O型和A型口蹄疫抗原决定簇基因O21-O14-A21转化胡萝卜.通过筛选,获得潮霉素抗性愈伤组织,经胚状体再生得到156棵抗性苗.通过GUS染色检测,GUS报告基因在部分转化的愈伤组织中瞬时表达,并在部分抗性苗中稳定表达.对部分抗性植株进行PCR和PCR-Southern杂交检测,证实目的基因已经成功整合到胡萝卜基因组中.     

HCO3 - 高亲和转运蛋白操纵子基因在聚球藻7942 CO2浓缩机制中功能的研究

蓝藻 Synechococcus sp.PCC7942 HCO3 - 高亲和转运蛋白操纵子基因 cmpABCD 是其CO2浓缩机制中的调控基因之一.本研究用携带潮霉素B磷酸转移酶基因(hygromycin B pho transferase, hpt) 筛选标记的同源双臂整合载体pUC-HATH转化蓝藻Synechococcus sp.PCC7942,以潮霉素B作为筛选试剂筛选出具潮霉素B抗性的转化藻,运用引物PCR方法证实潮霉素B磷酸转移酶基因表达盒通过质粒pUC-HATH的介导已定点插入蓝藻 Synechococcus sp.PCC7942 基因组中,成功地构建了具有潮霉素B抗性的cmpBCD 基因插入失活突变藻株.并最终通过比较野生藻Synechococcus sp.PCC7942 和突变藻Synechococcus sp.PCC7942 在不同 Na2CO3浓度的改良BG-11培养基中生长特性,探讨了HCO3 -高亲和转运蛋白操纵子 cmpABCD 基因失活对藻体生长的影响.     

口蹄疫抗原决定簇融合基因转化胡萝卜的研究

利用转基因植物生产疫苗是目前植物基因工程的一个研究热点，具有生产简单、成本较低、使用安全方便、易贮存等优点．本实验通过农杆菌介导的遗传转化．以O型和A型口蹄疫抗原决定簇基因O21-O14-A21转化胡萝卜．通过筛选．获得潮霉素抗性愈伤组织。经胚状体再生得到156棵抗性苗．通过GUS染色检测．GUS报告基因在部分转化的愈伤组织中瞬时表达．并在部分抗性苗中稳定表达．对部分抗性植株进行PCR和PCR—Southern杂交检测．证实目的基因已经成功整合到胡萝卜基因组中．     

原球茎为转化受体的农杆菌介导石斛遗传转化

以携带双元载体pCAMBIA1305.1的农杆菌菌株EHA105转化石斛种子萌发形成的原球茎,通过GUS瞬时表达检测对受体状态、农杆菌活化条件、共培养时间等转化影响因子进行了优化;共培养4 d的原球茎接种到含有30 mg/L潮霉素(Hyg)和500 mg/L头孢噻肟钠的愈伤组织诱导与增殖培养基上以获得潮霉素抗性的愈伤组织,抗性愈伤组织在含Hyg 50 mg/L的再生培养基上再生植株,抗性株经GUS组织化学、PCR和PCR-southem blot检测证明为转化株。     

农杆菌介导的Bt基因转化马铃薯的研究

马铃薯块茎蛾的危害极为严重,通过植物基因工程将Bt基因的Cry1Ab类型导入马铃薯,以期获得抗虫性提高的马铃薯基因工程植株.以马铃薯品种‘会-2’为受体材料,对影响转化效率的因素进行了优化,结果表明:3号(1/2MSO+50μLAs+2 mL农杆菌悬浮液)浸染液有利于抗性芽的分化,乙酰丁香酮可以提高叶片的转化率,共培养3 d的分化率较高.共获得经过卡那霉素筛选的114个转化植株,对初筛株系进行PCR分子鉴定,结果有55%的植株扩增出目的条带,初步证明Cry1Ab基因已整合到马铃薯的基因组中.转化植株的抗虫性鉴定正在进行中.     

转抗虫融合基因(cry1Ac3-cpti)玉米(Zeamays L.)植株的获得及其抗虫性分析

将苏云金杆菌家族中的cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)融合成融合基因，构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体，表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白．用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选，获得可育的再生植株．经PCR及Southernblot分子检测，证实所获得的再生植株为转基因植株．抗虫性分析结果表明，部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性．将苏云金杆菌家族中的cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)融合成融合基因，构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体，表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白．用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选，获得可育的再生植株．经PCR及Southernblot分子检测，证实所获得的再生植株为转基因植株．抗虫性分析结果表明，部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性．     

以抗生素抗性为选择标记的毛壳菌种间原生质体融合

以抗生素抗性为选择标记进行角毛壳菌和球毛壳菌种间原生质体融合。角毛壳菌CH21-I-402菌株对潮霉素有抗性、对G418敏感,球毛壳菌CH08对潮霉素和G418敏感。根癌农杆菌介导的新霉素磷酸转移酶基因转化球毛壳菌,得到成功转化新霉素磷酸转移酶基因的球毛壳菌菌株,转化子对G418抗性提高3~4倍,对潮霉素仍然比较敏感。以耐潮霉素、不耐G418的角毛壳菌和不耐潮霉素、耐G418的球毛壳菌为出发菌株,以PEG6000为助融剂进行原生质体融合,用G418和潮霉素抗性进行筛选,获得再生菌株。经AFLP分析表明:再生菌株PF1、PF26为融合菌株,融合菌株菌落形态均与亲本存在明显差异。     

笋玉米原生质体培养及遗传转化的研究

以自花受粉的笋玉米幼胚为外植体建立了胚性细胞悬浮系,酶解游离原生质体通过液体浅层培养得到了再生植株;通过PEG法和电激法对原生质体进行了遗传转化,转化用外源基因是潮霉素抗性基因和BT基因,原生质体再生愈伤组织经潮霉素筛选后,PEG法和电激法获得抗性愈伤组织的频率分别为9 3%和8.9%,Southem-blotting证明外源基因已整合到玉米抗性愈伤组织细胞基因组中,转基因工程植株的分化工作在正在进行中.     

钝齿棒杆菌乳酸脱氢酶基因敲除载体构建

乳酸脱氢酶催化丙酮酸生成乳酸是钝齿棒杆菌厌氧发酵产乳酸的关键酶。文章以构建乳酸脱氢酶基因敲除载体为目的,通过在乳酸脱氢酶基因片段中的EcoRV酶切位点插入卡那霉素抗性基因的方法构建钝齿棒杆菌乳酸脱氢酶基因敲除载体。结果显示,成功扩增并克隆到乳酸脱氢酶基因与卡那霉素抗性基因,质粒聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与酶切结果显示,卡那霉素抗性基因准确插入到乳酸脱氢酶基因中的EcoRV酶切位点,钝齿棒杆菌乳酸脱氢酶基因敲除载体构建成功。     

绿色荧光蛋白(GFP)基因在短小芽孢杆菌中的组成型表达

采用PCR技术,亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组中的启动子活性片段F1,构建了一个大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-F1gfp,以缺失启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,检测了该片段在短小芽孢杆菌DX01菌株中的启动活性,在荧光显微镜下,观察到了明亮的绿色荧光,证实活性片段F1具有组成型启动子的功能,GFP基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达．     

转多个抗真菌蛋白基因水稻植株的获得及其抗稻瘟病菌的初步研究

用基因枪法将水稻碱性几丁质酶（ＲＣ２４）基因、苜蓿葡聚糖酶（βＧｌｕ）基因、大麦核糖体失活蛋白（ＢＲＩＰ）基因和潮霉素（ｈｐｔ）基因同时导入籼稻品种（七丝软占）中,获得了７个潮霉素抗性再生系,Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明２～３个抗真菌蛋白基因已整合到水稻基因组中．初步抗性鉴定表明Ｒ０代转基因水稻植株对稻瘟病菌的抗性有所提高     

GUS和HPT基因的基因枪法转化水稻

以水稻（丹粳－５号）愈伤组织为受体材料，采用基因枪法将含有ＧＵＳ和ＨＰＴ基因的ＣＭ２质粒导入水稻细胞．经过５０ｍｇ／Ｌ的潮霉素筛选，获得抗性愈伤组织，并在同样筛选压力下诱导分化成苗，获得抗性苗．共获得１７个抗性克隆．ＧＵＳ组织化学检测表明，有１２个克隆为ＧＵＳ阳性，ＧＵＳ和ＨＰＴ基因共表达率为７０％左右．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子检测证明ＨＰＴ基因已整合到水稻基因组中．     

根癌农杆菌介导的丝状真菌简青霉遗传转化的研究

利用根癌农杆菌LBA4404介导,建立了丝状真菌简青霉(Penicillium simpli-cissimum)H5的遗传转化系统.潮霉素抗性筛选、PCR和Southern blot分子鉴定等结果表明:筛选获得的转化子能够稳定遗传,外源的T-DNA以单拷贝随机整合到简青霉的基因组中.实验初步研究了农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度和共培养时间等因素对转化效率的影响,经过优化后转化体系的效率可达50个转化子/105个孢子.农杆菌介导的遗传转化方法在简青霉上的运用,将为研究该菌的基因工程改造提供强有力的工具.     

两种遗传标记筛选物在马铃薯Desiree遗传转化应用中的研究

以马铃薯茎段为外植体,采用农杆菌介导法,将带有Bar和hpt基因的植物表达质粒载体转入马铃薯栽培品种Desiree,并对遗传转化过程中的预培养时间、抑菌素浓度、筛选物抗除草剂Basta和潮霉素的浓度等因素进行了研究.结果表明:预培养时间2 d转化效率最高;头孢霉素浓度为300 mg/L时,能够有效的抑制农杆菌的生长;以除草剂Basta为筛选物时,适宜的筛选压为0.6 mg/L,用潮霉素(Hyg)作为筛选物时,以15 mg/L为最合适;获得的转基因植株经PCR分析,证实Bar基因己经整合到马铃薯基因组DNA中,从而建立了以除草剂Basta或以潮霉素为遗传标记筛选物的马铃薯栽培品种Desiree的遗传转化体系,为利用基因工程进一步改良马铃薯品质奠定了基础.     

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1/2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA,重组到植物表达载体pROKII中,通过致瘤农杆菌(A-grobacteriumtumefaciens)介导,以叶圆片为转化材料,转化普通烟草,并获得了转基因植株.经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中.转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性.