水分胁迫诱导表达的小麦基因的cDNA片段克隆和序列分析

以３０％（－１．３１ＭＰａ）ＰＥＧ－６０００对小麦幼苗进行重度水分胁迫处理,利用ｍＲＮＡ差异显示技术分离了水分胁迫诱导表达的小麦基因ｄｉｌｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ,ｄｉ１）的ｃＤＮＡ片段,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明,ｄｉ１基因在水分胁迫１０ｈ后表达开始增强并随着水分胁迫时间的延长而增强,水分胁迫４８ｈ时其表达最强。对ｄｉｌ基因的ｃＤＮＡ片段进行了克隆和序列测定（２１１ｂｐ）     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

沙芦茎高效表达的胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖脱水酶与水分胁迫相关

用c DNA-AFLP分析了3种不同生态型芦苇之间基因表达的差异,发现沙丘芦苇和盐生芦苇对干旱或盐胁迫逆境的适应可能涉及为数不多的基因,克隆了沙芦胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖脱水酶（Phragmites communis dTDP-D-glucose dehydratsse,pcTGD）的全长cDNA,发现pcTGD基因在芦苇茎中高效表达,但在3种生态型根茎中,只在沙丘芦苇根茎中特异表达,同时,在沙丘芦茎中该基因表达量远远高于其他两种生态型,而在移栽的植株中表达量明显下降,推测pcTGD在沙芦适应水分胁迫的渗透调节机制中发挥作用。     

拟南芥QRAP2基因的克隆、表达、DNA结合能力及体外转录活性分析

通过对拟南芥ATH1基因芯片数据的分析, 从拟南芥中鉴定到一个受干旱胁迫高水平诱导的cDNA片段, 并用RACE方法获得了其全长cDNA. PCR及定量实时PCR分析表明, 该基因在经干旱、紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理后短时间内表达量迅速提高, 3 h后即提高到对照样品的430多倍. 通过多序列比对和系统进化分析, 我们将该基因归于DREB亚家族. 由于该基因编码蛋白含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域, 并在N端有一段富含谷氨酰氨残基的区域, 所以将它命名为QRAP2 (Glutamine-rich AP2). 凝胶阻滞实验结果显示, QRAP2蛋白能够特异结合DRE顺式元件序列但不能与mDRE和GCC等非相关元件结合. 酵母单杂交实验表明, QRAP2蛋白全长序列或其N端112个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域形成的融合蛋白表现出转录激活功能, 而其C端135个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白则没有表现出转录激活活性. 现有资料的分析表明, QRAP2是AP2/EREBP转录因子家族的新成员, 可能在干旱胁迫条件下参与激活相关下游基因的表达.     

13个水稻WRKY基因的克隆及其表达谱分析

转录调控因子WRKY蛋白拥有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和Cys₂His₂或Cys₂HisCys锌指型结构. 利用WRKY蛋白质的保守结构域, 搜索了整个水稻基因组编码WRKY蛋白质的基因, 鉴定了97个WRKY基因, 并从4℃胁迫的水稻植株cDNA文库中获得13个WRKY基因全长cDNA克隆. Northern blotting分析结果显示, 其中10个WRKY基因的表达受到NaCl, PEG, 低温(4℃)和高温(42℃)等4种非生物逆境因子胁迫的影响, 但其诱导表达模式不论在逆境因子种类还是在诱导时间上均存在着很大的差异, 这种基因诱导表达模式的差异可能体现于它们之间的生物学功能的差异.     

豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因的cDNA克隆及其表达

用cDNA差示分析法从G2豌豆总RNA中筛选到一个GA3特异诱导表达的基因片段,用该片段作探针进一步筛选G2豌豆cDNA文库,得到一个全长2036bp的cDNA序列。经分析,该cDNA含有一个1746bp的可读框,编码的蛋白质含有581个氨基酸,理论分子量为64ku,cDNA及推导的氨基酸序列分别与不同来源的乙酰羟酸还原异构酶相应序列有较高的同源性。将该基因转入表达载体中并在大肠杆菌中表达,获得了具有显著酶活性的外源蛋白。     

水稻减数分裂相关基因OsDMC1的克隆

酵母DMC1基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的减数分裂特异基因,其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的,根据在酵母Dmc1与拟南芥AtDmcl中保守的氨基酸motifs合成的简并性引物,以cDNA作模板,通过套式PCR（nested PCR）和RACEs克隆了水稻中酵母DMC1的同源基因OsDMC1,OsDMC1全长的cDNA是1348bp,编码344个氨基酸组成的多肽（OsDmcl）,OsDmcl与Dmcl和AtDmcl的氨基酸序列一致性分别是51．8％和81．7％,OsMDC1在生殖器官中表达量较高,在根中有少量表达,而在叶和幼芽中不表达,Southern blot分析结果表明水稻基因组中有两个拷贝的OsDMC1。     

强MAR的分离及其体内外功能鉴定

将MAR（matrix attachment region)构建到外源基因表达盒两侧可以促进外源基因的表达克服基因沉默。用PCR方法从烟草和拟南芥中分离到4个新的MAR序列（TM2，TM3，AM1和AM2），以水稻悬浮细胞为材料，提取大量细胞核制备核基质，以已发表的MAR（TM1）和对照，对4个新MARs序列进行体外结合实验，结果表明TM2和TM3与核基质的结合能力强于已知MAR序列。将4个新MARs和对照分别顺向构建和表达载体pBI121 gus基因表达盒两侧，用农杆菌介导法转化烟草，获得转基因植株。对转基因植株体内GUS酶活性检测表明，TM1，TM2，TM3和AM1均能命名外源基因表达增强，其中TM2增强5倍，TM1增强1．5倍，TM2增强效果强于对照TM1。表明分离到一个新的强MAR，可以用于高效表达载体的构建。对5个MARs的序列特征、体外结合能力及外源基因表达影响三者之间的关系进行了分析，并对获得的强MAR在植物基因工程中的应用进行了讨论。     

大豆转录因子GmWRKY57B的基因克隆及功能分析

WRKY类转录调控因子在高等植物中构成一个基因超家族, 它不但广泛参与了植物对非生物胁迫和生物胁迫的反应, 还参与了生长发育及多种代谢途径的调控. 本研究构建了一个大豆cDNA文库, 采用酵母单杂交的方法, 用来自AtNPR1启动子区的W-box对构建的大豆cDNA文库进行筛选, 获得了GmWRKY57B基因, 该基因全长1033 bp, 编码299个氨基酸, 属于WRKY类转录因子的第Ⅲ组; 酵母挽救实验及凝胶阻滞实验均表明, GmWRKY57B能够与W-box特异性结合; 酵母体内的转录激活实验表明, GmWRKY57B在酵母细胞中具有转录激活功能; GmWRKY57B在大豆根、茎、叶中均有表达; GmWRKY57B基因在烟草中的过表达能够提高转基因烟草植株的抗旱性, 表明GmWRKY57B 基因在非生物逆境中有一定的功能.     

水稻油体钙蛋白家族的进化及对干旱胁迫的响应性分析

油体钙蛋白不仅参与了油体的形成, 而且可能与植物耐受干旱胁迫有关. 目前对水稻中的油体钙蛋白的功能了解很少. 本文通过对水稻基因组数据库的序列搜索, 确定了水稻油体钙蛋白基因家族的6 个成员. 通过对这些基因的序列、结构和染色体位置分析, 表明水稻油体钙蛋白基因家族的扩增可能与片段复制和串联重复有关. 通过对这些基因与其他物种中的油体钙蛋白基因的系统进化分析及功能比较分析, 揭示了拟南芥和水稻中功能可能对应的成员. 为了确定与干旱胁迫响应相关的油体钙蛋白基因, 通过荧光定量PCR 检测了水稻油体钙蛋白家族在根、叶、花中的表达, 以及在这些组织中响应干旱胁迫的表达情况, 发现有3个基因成员在不同组织中受干旱胁迫的诱导, 为进一步对它们展开功能分析奠定了基础.     

DPH2L基因在细胞分化/凋亡中的降调节——mRNA差异显示的应用

为鉴定维甲酸诱导的人肺癌细胞分化/凋亡相关基因,采用mRNA差异显示的方法对全反式维甲酸处理前后的人肺腺癌细胞系GLC82的mRNA表达模式进行了分析。6个cDNA片段被分离和克隆。其中1个对应于序列已知而功能未知的人DPH2L基因。该基因的2.3kb全长cDNA最初是从人卵巢癌的关键缺失位点17p13.3上分离出来,并被认为是一个候选的肿瘤抑制基因。结果显示DPH2L是一个广泛表达的基因,除已报道的2.3kb转录本外,还有另外一个1.7kd的主要转录本。在全反式维甲酸和N-（4-羟苯）维甲酰胺4HPR诱导的几种肿瘤细胞的分化/凋亡过程中DPH2L呈降调节,由此提示DPH2L可能并不起肿瘤抑制基因的作用,相反,它的降调节可能参与了从细胞生长到细胞分化或凋亡的转换过程。     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离及其启动子功能分析

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

水稻紫黄质脱环氧化酶基因的克隆、体外表达及酶促反应

从水稻中克隆了紫黄质脱环氧化酶（VDE）基因，其全长cDNA序列为1887bp，编码446个氨基酸，其中转运肽长98个氨基酸，构建了该基因的原核表达载体pET-Rvde，在0.4mmol/L IPTG的诱导下，外源蛋白大量表达，其分子量与天然的VDE蛋白一致，表达量随诱导时间而增加。Western杂交表明表达蛋白与VDE的多克隆抗体有免疫反应，将表达蛋白用于紫黄质的脱环氧化反应，吸收光谱及HPLC分析结果表明，表达蛋白能在体外催化紫黄质转变成为玉米黄质和环氧玉米黄质。     

水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定

以优良杂交水稻的恢复系明恢63为材料，构建覆盖水稻基因组的cDNA文库，用于功能基因组的研究。选择水稻全生育期过程的9个时期的不同组织和病原诱导的组织分别构建了15个定向cDNA文库。依据基因组DNA饱和杂交的原理，将从15个独立的cDNA文库中提取的质粒混合，并与固定有磁珠上具有互补性的2份基因组DNA亲和体系饱和杂交，收集杂交组分中的质粒并重新转化大肠杆菌，获得全生育期均一化cDNA文库。该文库平均插入片段1.4kb，含62000个克隆子。反向Northem杂交显示，该文库收集了众多表达丰度极低的基因以及特异表达的基因。对文库中随机的10750个克隆进行了测序，序列分析比较后获得6399条非重复的EST(expressed sequence tag)序列，非重复序列占59.5％。目前，用该文库制作的cDNA芯片已被用于功能基因组的研究。     

高等植物基因的内含子

针对高等植物基因的内含子结构和功能的研究现状进行了评述，内含子是真核基因的一个重要组成部分，对其结构和功能的认识随着研究的深入而不断变化（或华），高等植物基因内含子的结构特征既有保守性，又有差异，它的剪辑过程涉及诸多频式元件和反式因子之间的相互作用，如5′剪辑位点、3′剪辑位点以及各种蛋白质因子，高等植物基因内含子的剪辑过程是真核生物表达的一个重要环节，特别是内含子的可为剪能够调节基因的时空表达。另外，高等植物基因内含子序列在基因表达调控中也具有重要作用，如影响基因的表达模式、增强基因的表达水平和启动基因的表达等。     

水稻的病程相关基因简

在几乎所有的植物中都有病程相关（pathogenesis-related,PR）基因的报道,其广泛存在及序列特征和功能的保守性提示着其重要性. 最初发现PR基因主要是由于它们在植物受到病原物侵染时会大量表达. 但近年来的研究表明,PR基因在衰老、伤害、非生物逆境胁迫、激素处理甚至正常生长发育过程中也发挥着作用. 由于PR基因种类、数目较多,前期的命名系统不统一,给深入了解PR基因的功能造成了不便. 本文系统整理了水稻PR基因的相关报道,集合了PR基因的类别、数目、名称、注释信息、代表性基因的功能,归纳了PR基因在抗病、抗逆和发育过程中的转录或表达特征及转PR基因后的表现,并以Loc号和序列为核心,将文献中有不同名称的同一基因进行了对应. 另外,还展望了水稻PR基因研究的意义和今后的重点研究方向,以供同行参考.     

基于抑制消减杂交方法的小麦抗白粉病相关基因表达谱

以抗白粉病品系“百农3217×Mardler”BC_5F_4为材料,构建了一个白粉病菌接种初期的抑制消减杂交cDNA文库,获得760条表达序列标签（expressed sequence tags, EST）.在 GenBank上进行BLASTn与 BLASTx分析,结合文库高密度点阵膜的杂交差示筛选,获功能已知的抗病相关EST 65种,199条.通过分析抗病相关基因表达谱,推测 SA（salicylic acid）信号传递系统、MAP相关信号传递系统等参与了小麦抗白粉病过程.SAR（systemic aquired resistance）系统基因在表达谱中的种类与数量最多.伴随着细胞防卫反应的启动,细胞保卫机制也被激活,抗氧化物质基因大量表达.较多证据证明苯丙烷代谢途径参与了抗白粉病植保素的合成;检测到几种细胞壁结构修饰酶和抑制病原菌生长的蛋白酶抑制因子.以半胱氨酸蛋白酶为主的几种蛋白酶基因在已知功能EST中有一定的表达频率.