GGT酶法合成γ-谷氨酰半胱氨酸

以大肠杆菌K-12基因组中克隆表达的γ-谷氨酰转肽酶作为催化剂,L-谷氨酰胺和胱氨酸为底物合成γ-谷氨酰胱氨酸,经还原生成γ-谷氨酰半胱氨酸.考察反应时间、酶浓度、补料方式等可能对酶促反应过程产生影响的因素,在L-谷氨酰胺0.1 mol/L、胱氨酸0.2 mol/L、酶浓度0.024 U/m L及p H为10.0的条件下,40℃反应12 h,γ-谷氨酰半胱氨酸的最大浓度为6.13 g/L,L-谷氨酰胺的最大转化率为24.5%.     

长蛸胃肠道产蛋白酶菌的筛选及粗酶性质研究

通过透明圈法从长蛸胃肠道内筛选出4株产蛋白酶的菌株, L 1、L 2、L 3、L 5, 采用偶氮酪蛋白法测定粗酶液蛋白酶活力, 采用SDS PEAG活性电泳测定粗酶液中具有蛋白水解活性的蛋白酶的种类及分子量. 菌株L 2产蛋白酶比酶活最高, 达到4.80U/μg, 菌株L 1比酶活最低为3.31 U/μg. 菌株L 2粗酶液中含有4种酶活较高的蛋白酶, 分子量分别为105.2、86.9、69.3、37.8kD, 其他3株菌株的粗酶液中各蛋白酶分子量相近. 菌株L 1和L 2蛋白酶最佳反应温度为40℃, 最佳反应pH为8.0; L 3产蛋白酶的最佳反应温度为50℃, 最佳pH为7.0; 菌株L 5产蛋白酶在温度为60℃, pH为8.5时有最大酶活力.     

γ-聚谷氨酸高产菌株的选育及发酵条件优化

以聚谷氨酸(γ-PGA)产生菌Bacillus subtilisHD-23为出发菌株,采用紫外线-硫酸二乙酯-亚硝基胍三因素的多组复合诱变,获得菌株Bacillus subtilisHD-F9,γ-PGA产率达到10.72 g/L,提高了56.3%,且传代稳定.对菌株Bacillus subtilisHD-F9的发酵培养基配比进行正交设计优化,并对其摇瓶培养条件进行优化,得到最佳发酵条件为:葡萄糖50 g/L,酵母膏8 g/L,谷氨酸钠40 g/L,250 mL三角瓶装液40 mL,初始pH 7.5,37℃,200 r/min,振荡培养48 h,γ-PGA产量可达14.88 g/L,提高38.8%.     

全细胞生物转化法制备γ-氨基丁酸

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)是广泛存在于自然界的一种非蛋白质的功能性氨基酸.它是哺乳动物中枢神经中一种重要的抑制性神经递质.为了高效廉价制备GABA,采取谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)催化L-谷氨酸生成GABA的工艺.从K12来源的大肠杆菌(E. coli)基因组中PCR扩增得到GAD基因片段,并克隆到载体p ET-23a中,得到重组质粒p ET-23a-K12gad,并将其转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中,获得了能够重组表达GAD活性的工程菌株.从反应温度、p H、菌体量这三个方面对催化工艺进行了优化.为了进一步降低成本,通过化学法将谷氨酸钠转化为谷氨酸作为催化底物,提高转化速率的同时简化了纯化工艺.     

微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化

对已构建的工程菌株pET22b-MTG/E.coli BL21（DE3）进行质粒酶切和PCR鉴定,优化诱导温度、时间、pH和乳糖浓度等反应条件,采用乳糖自诱导培养基培养重组菌.并将重组菌上清液经凝胶过滤,离子交换及镍柱亲和层析后,对谷氨酰胺转胺酶纯化和SDS-PAGE电泳分析.结果表明：谷氨酰胺转胺酶在28℃,添加乳糖为1.2g/L诱导18 h,pH为7.0,培养11.5 h时升温至50℃诱导1 h,再放至28℃培养,表达效果较好,超过IPTG诱导效果.纯化后酶活为7.5 U/mL,比活力为10.9 U/mg.     

双酶法制备L-天冬氨酸的循环生产工艺

目前,工业上采用化学法将马来酸转化为富马酸,然后用L-天冬氨酸裂解酶菌株全细胞催化富马酸和氨水生产L-天冬氨酸,并采用硫酸酸化方法使L-天冬氨酸结晶。两步催化反应步骤繁琐,并且全细胞催化富马酸为L-天冬氨酸的菌体消耗量大,硫酸结晶法会产生废品硫酸铵。为了克服以上不足,将两步反应合并,利用实验室构建的马来酸异构酶和L-天冬氨酸裂解酶共表达的大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3)Bptm-Easp)细胞裂解液催化马来酸铵生产L-天冬氨酸;对酶催化反应条件进行了优化,得到最佳条件：采用pH8.0的200 g/L马来酸铵溶液作为底物,加入马来酸异构酶总活力为2 000 U/L的E.coli BL21(DE3)Bptm-Easp细胞裂解液,于40℃反应24 h,马来酸可转化完毕;反应液经活性炭脱色后,采用马来酸代替硫酸使L-天冬氨酸结晶,经洗涤、干燥后得到L-天冬氨酸晶体,结晶收率达到81.80%;采用碳酸氢铵和少量氨水中和结晶后的马来酸滤液,作为下一批次反应的底物溶液;在此基础上进行了4批次马来酸滤液转化反应,马来酸转化率均在99%以上,L-天冬氨酸结晶收率均在80%以...     

高产γ-氨基丁酸的红曲霉菌株筛选及发酵条件优化

从实验室保藏的11种红曲霉中,筛选出高产γ-氨基丁酸的红曲霉CH-1菌株.研究了发酵温度、时间、接种量、谷氨酸钠添加量等发酵条件对红曲霉CH-1产GABA含量的影响.经单因素实验及正交试验后得出红曲霉CH-1发酵大米产γ-氨基丁酸的较佳发酵条件为：发酵温度30℃,发酵时间9 d,接种量17%,谷氨酸钠添加量0.10 g,在此条件下,红曲霉CH-1发酵大米产GABA为1.93 mg/g,经高效液相色谱检测,桔霉素含量为0.01μg/g,低于国家标准1μg/g,可利用该产品开发更多形式的红曲食品.     

结核分枝杆菌H37Rv组氨醇脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增hisD基因,构建pET-28a-HDH重组质粒;转化重组质粒到E.coli BL21(DE3)并诱导表达,纯化可溶性的结核分枝杆菌L-组氨醇脱氢酶(HDH),并对其性质进行研究,结果表明:重组结核分枝杆菌L-组氨醇脱氢酶能以L-组氨醇和NAD 为底物催化L-组氨醇生成L-组氨酸;该酶的最适pH值为8.3,最适温度为45℃,比活力为1.788 U/mg;Mn2 ,Ca2 ,Zn2 ,Co2 等对酶促反应有激活作用;底物NAD 和L-组氨醇的米氏常数分别为0.9765 mmol/L和2.755μmol/L;25℃时重组蛋白的二级结构中有20.5%的α-螺旋,40.9%β-折叠,4.2%β-转角,34.3%无规卷曲.     

乳酸菌发酵小米糠生产y-氨基丁酸的配方和条件优化

以廉价的农副产品小米糠为培养基原料,L-谷氨酸钠（L-MSG）为合成底物,利用实验室筛选的短乳杆菌发酵生产y-氨基丁酸（GABA）．通过单因子实验探讨了短乳杆菌发酵生产y-氨基丁酸过程中pH、培养温度、培养时间、小米糠及底物添加量的影响．结果表明：适宜的培养条件为pH4．00,30℃,培养72h;优化的培养基组分为小米糠70g/L,谷氨酸钠50g／L．在优化的培养基和发酵条件下,发酵液中y-氨基丁酸的产量可达32．037g／L．     

微生物发酵法合成高分子聚合物γ-PGA的研究

以一株γ-聚谷氨酸高产菌枯草芽孢杆菌B-115为实验菌株,分别考察碳源、氮源种类及浓度、前体物添加量、生长因子和发酵条件对γ-聚谷氨酸产率的影响.优化结果显示:碳源是6.5%的玉米糖化液,氮源是0.4%的普通蛋白胨,前体物谷氨酸钠的添加量为4%,生长因子种类及添加量分别为0.15%硫酸镁、0.006%硫酸锰、0.8%磷酸二氢钾、1.0%氯化钠、0.03%氯化钙;发酵条件为初始pH值6.5,接种量2%,装液量50 mL/250 mL1,50 r/min3,7℃培养84 h;γ-聚谷氨酸的产率可从57.85 g/L提高到68.30 g/L.     

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E. coli BL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/L IPTG诱导E. coli BL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。     

固定化谷氨酸脱羧酶转化γ-氨基丁酸的研究

研究卡拉胶制备固定化谷氨酸脱羧酶及转化γ-氨基丁酸(GABA)的最适条件.以本实验室研发的诱导剂对构建的表达谷氨酸脱羧酶(GAD)的基因工程菌进行诱导,并利用卡拉胶对获得的粗酶液进行包埋制备固定化酶,对影响GAD固定化效果和GABA产量的因素进行研究.最佳固定化条件为卡拉胶浓度1.5%,氯化钾浓度3%,硬化时间2 h;转化GABA的最适条件为反应最适pH为3.8～4.3,最适温度为37℃～43℃,将制得的固定化谷氨酸脱羧酶(IGAD)重复使用7次后,催化活力仍保持在最初值的75%;IGAD在最适底物浓度60 mmol/L下反应时间2 h后谷氨酸转化率达99%,利用IGAD进行连续催化反应,最终GABA摩尔转化率为70.98%,晶体得率为91.90%,晶体纯度94.73%.该法具有较好的操作稳定性和较高的底物转化率,为连续化制备γ-氨基丁酸提供参考.     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

产烟酸羟化酶菌株Pseudomonas sp BK-1培养条件的研究

对产烟酸羟化酶的菌株Pseudomonas sp.BK-1的培养条件进行了优化,结果表明10g.L-1蔗糖为最佳碳源,20g.L-1玉米浆为最佳氮源,诱导物烟酸浓度12.5g.L-1,培养基的最适初始pH值7.0.5L发酵罐中进行发酵,在转速400r.min-1、通气量4.2L.min-1、30℃条件下,16h时酶活可达1.47U.mL-1.经36h的连续催化,产物6-羟基烟酸的浓度可以积累到154g.L-1.     

一株产高温纤维素酶曲霉菌的发酵条件及培养基优化

对一株产高温纤维素酶的曲霉(Aspergillus sp.)F4菌株进行培养基及发酵条件的优化.最佳产酶液体培养基配方为:稻草粉40 g·L-1,(NH4)2SO43.5 g·L-1,NaCl 2 g·L-1,KH2PO42 g·L-1,MgSO4.7H2O 0.5g·L-1,甘油0.20%,pH 5.5;优化后CMC酶活力提高16.7倍.优化后产酶条件为:接种量4%,温度37℃,摇床转速150 r.min-1,装液量80 mL/250 mL.在此条件下发酵8 d,CMC酶活力达到了12.26 U.mL-1,比优化前提高了约2倍.     

重组细胞色素P450 BM-3突变酶在大肠杆菌中催化吲哚合成靛蓝

重组细胞色素P450 BM-3突变酶在大肠杆菌（E.coli）BL21得到表达，利用重组菌株细胞催化吲哚合成靛蓝.考察了底物、产物、葡萄糖浓度以及pH值和温度对反应的影响.结果表明：pH 7.0—7.5，温度35℃，底物浓度0.5mmol/L为较好的反应条件.在此条件下，反应进行8h后，靛蓝产率可以达到29.43%.产物靛蓝对合成反应具有一定的抑制作用，在反应体系中加入5g/L葡萄糖，可以将产率提高到44.08%.     

重组E.coli L-天冬酰胺酶的克隆及表达与纯化

以大肠杆菌菌株(E.coli AS 1.357)基因组为模板,PCR扩增L-天门冬酰胺酶Ⅱ基因(ans B),构建p MD18-Tans B重组克隆载体和p ET-22b-ans B重组表达载体,转化大肠杆菌BL21宿主菌株,重组工程菌经IPTG诱导表达Ans B蛋白,利用重组His-tag,通过Ni-NTA亲和层析纯化Ans B蛋白,利用SDS-PAGE定性分析Ans B蛋白,考马斯亮蓝法测定Ans B蛋白含量,获得纯化的质量浓度为62.7 mg/L的Ans B表达蛋白。重组L-天门冬酰胺酶的纯化收率为42.28%,酶活达137 IU/m L,较原始菌株的(6.87 IU/m L)提高近20倍,并排除大肠杆菌自身L-天门冬酰胺酶本底表达背景。     

海洋细菌THN1发酵产右旋糖酐酶的条件优化及酶学性质研究

为提高海洋细菌THN1产右旋糖酐酶的能力，本研究利用单因素试验和响应面试验对菌株THN1的发酵条件进行优化，并探究菌株THN1右旋糖酐酶的酶学性质。优化结果表明，菌株THN1的最佳产酶条件为麸皮5 g/L、胰蛋白胨20 g/L、NaCl 10 g/L、右旋糖酐T20 5 g/L，陈海水配置，pH值为8.2，30℃培养24 h。在此条件下，菌株THN1的发酵液酶活力达到3.71 U/mL，是优化前（初始酶活力为0.12 U/mL）的31倍。酶学性质分析表明，右旋糖酐酶的最适反应温度为40℃，在30℃条件下放置5 h酶活力基本保持稳定；最适反应pH值为7.5，在pH值为5.0-9.0的条件下相对酶活力能保持50%以上。本研究成果可为缩短右旋糖酐酶生产周期和降低成本提供数据支撑，并认为菌株THN1右旋糖酐酶在口腔护理方面具有良好的应用潜力。     

海洋弧菌NTi产琼胶酶的发酵条件优化

以琼胶酶活力为主要指标,采用单因素与响应面相结合的方法,对降解琼胶的海洋弧菌NTi(Vibrio natriegens NTi)发酵产琼胶酶的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行优化。结果表明,α-乳糖对菌株产酶具有较强的抑制作用,NH+4不利于菌株生长和产酶。培养基分别以3. 3 g/L琼脂、6. 33 g/L酵母膏为唯一碳源及氮源,添加20 g/L的Na Cl,发酵海洋弧菌V. natriegens NTi产琼胶酶的效果最佳。发酵过程中的p H值、接种量、装液量、温度、发酵时间最优值分别为6. 5、2%、32 m L、27℃和24 h。优化后,该菌产琼胶酶活力达到2. 81 U/m L,比优化前增加了230%。     

短乳杆菌来源重组β-半乳糖苷酶初步分离纯化与酶学特性研究

将实验室克隆得到的E. coli BL21/pET28a-bga B-18重组菌株在IPTG的诱导下进行表达,对其表达的β-半乳糖苷酶性质进行研究.首先,通过离心收取重组菌菌体;其次,通过超声破碎菌体细胞,再用镍柱对重组蛋白质进行亲和层析;最后,收集层析液,再利用紫外分光光度计测定重组β-半乳糖苷酶活性,并研究其酶学性质.结果表明:该酶的最适反应温度为37℃,最适pH值为7.5;在温度30～50℃、pH 6.0～8.0范围内酶稳定性较好; Mg~(2+)、Mn~(2+)为其激活剂,Cu~(2+)为其抑制剂;测得K_m=0.816 mmol/L,V_(max)=45.87 mmol/(L·min).