小黄鱼精液超低温冷冻保存技术的试验研究

为了研究小黄鱼精液超低温冷冻保存技术,分别比较了3种抗冻剂、3种降温方法和2种复温温度对冷冻精液的影响。结果表明:采用Riger’s液作为稀释液、10%DMSO为抗冻剂,冷冻精液的激活率和受精率最高,与其他两个实验组差异显著(P0.05),分别为92.36%和81.36%;以10℃/min的降温速率将精液降至-80℃后液氮保存,40℃水浴解冻比室温解冻可以获得更好的受精效果,受精率和孵化率分别为78.47%和75.47%。     

不同解冻方法对辽宁绒山羊精子活力的影响

通过比较三种精液冷冻保存稀释液配方（A、B、C）对山羊细管冷冻精解冻后精子活力的影响,结果表明,三种稀释液配方（A、B、C）,冷冻-解冻后精子活力有极显著的差异（P〈0．01）,分别为42．57％、37．34％、33．03％,A显著优于B液和C液．而且用不同的水浴温度和解冻时间进行解冻,通过精子活力的比较,寻找出最佳的解冻温度为38℃,解冻时间为60s．     

皱纹盘鲍精子的激活及超低温保存研究

用不同浓度的氨海水激活解剖获得的皱纹盘鲍精子并进行激活率和受精率的测定.以自然海水作基础溶液,以二甲基亚砜(DMSO)和甘油(Gly)做保护剂,在不同降温程序下,将解剖获得和经诱导自然排放的皱纹盘鲍精子置于液氮罐中保存24 h,解冻后检测精子的成活率.结果表明,加入自然海水后有64.27%的解剖精子被激活,但不能受精,经氨海水处理后的精子在0.02‰浓度条件下激活率和受精率最高,分别为85.60%、67.42%.自然排放和解剖获得的精子在14%DMSO、4℃平衡15 min,-20℃时平衡5min,-80℃时平衡5 min条件下精子存活率最高,分别为48.15%和64.01%.     

黄腹角雉精液的低温保存

1999— 2 0 0 3年从 17只笼养黄腹角雉 (Tragopancaboti)采集精液 ,稀释后分别保存于 4℃的冰箱和 - 196℃液氮中 .在 4℃条件下 ,保存于生理盐水、C 2液、Lake液、Beltsville液等不同稀释液中的精液 ,其精子存活状况相差很大 ,其中保存于Beltsville液中的精子存活率 (S)最高 ,4 8h后仍有 6 0 %以上的活精子 .在精液的冷冻保存方面 ,受降温过程中精子内外渗透压的变化和结晶的影响 ,且对于冷冻保护剂 (二甲基亚砜 ,DMSO)的体积分数 (φ)以及降温速度的选择非常重要 :DMSO的 φ过高 (如 10 % )或过低 (如 1% ) ,都会大幅降低冷冻后精子的S ,实验发现 φ为 4 %的DMSO最适于黄腹角雉精液的冷冻保存 ;以不同的速度降温 ,也显著地影响着精液的保存效果 (P <0 .0 5 ) .     

昆明小鼠未成熟卵母细胞OPS和SSV冷冻保存的比较

目的寻找昆明小鼠卵母细胞冷冻保存效率的新途径。方法选用5~6周龄雌性昆明小鼠的未成熟卵母细胞,在不同前处理液(10%EG或10%EG+10%DMSO)中平衡5 min,然后在冷冻液(EFS30、EFS40、EDFS30或EDFS40)中平衡30 s后进行OPS(Open pulled straw)法和SSV(Solid-surface vitrification)法玻璃化冷冻保存。结果小鼠未成熟卵母细胞的OPS法冷冻保存中,用EFS液冷冻的卵母细胞解冻后形态正常率最高为84.4%,成熟率低于16.7%;而在SSV法冷冻保存中,用EFS液冷冻的卵母细胞解冻后形态正常率最高为86.0%,成熟率为46.5%。OPS法和SSV法冷冻小鼠未成熟卵母细胞形态正常率为91.6%和91.4%,与对照组间差异较显著(P>0.01);成熟率为42.9%和59.1%,与对照组差异极显著(P<0.01)。结论多种抗冻保护剂组合使用效果好于单种抗冻保护剂;EDFS冷冻液冷冻保存效果好于EFS,尤其是EDFS30;OPS法可以有效地冷冻保存小鼠未成熟卵母细胞,且新型玻璃化冷冻法SSV法冷冻保存效果优于OPS法。     

松材线虫低温冷冻保存研究

为满足大量松材线虫虫株长期保存的需要,对其低温冷冻保存技术进行了研究。试验比较了不同种类及浓度冷冻保护剂对松材线虫在低温冷冻保存时的保护效果,以及冷冻线虫繁殖力与致病力的变化。结果表明:使用15%甘油和4%DMSO作为冷冻保护剂,经-80℃保存1 d后,松材线虫存活率分别为(39.4±6.6)%和(37.5±21.8)%,且冻存10 d、1个月后均没有显著性下降。与未冷冻的线虫相比,冷冻线虫的繁殖力与致病力均未发生改变。     

不同冷冻方法和解冻液对猪精液冷冻效率的影响

采用三种不同的冷冻方法冷冻猪的新鲜精液,再分别用不同的解冻液在相同条件下同时解冻,对比解冻后精子的活力和顶体完整率,以优化猪精液冷冻方法.实验一:随机选取三头健康的有稳定受精能力的优良种公猪,采集新鲜精液,分别用干冰颗粒、液氮颗粒和液氮细管三种方法冷冻,用同样的方法解冻,对比解冻后精子的活力和顶体完整率;实验二:用不同的解冻液解冻经干冰颗粒法冷冻的精液,对比不同解冻液对精子活力的影响;实验三:以孤雌激活和鲜精受精为对照,验证经实验一和实验二选择出来的最优冷冻方法和解冻液处理后的精子的体外受精能力.实验一显示,干冰颗粒冷冻法冷冻的猪精液解冻后精子活力(0.23)略高于液氮颗粒法的精子活力(0.20),而二者均显著高于细管冻精法的精子活力(0.08)(P<0.05),液氮颗粒法的顶体完整率(54.7%)和细管法的顶体完整率(54.2%)无显著差异,但二者均显著低于干冰颗粒法的顶体完整率(58.0%)(P<0.05).实验二显示,Glucose-EDTA解冻液解冻后,精子活力(0.22)显著高于DPBS-BSA解冻液解冻后的精子活力(0.13)(P<0.05).实验三:经干冰颗粒法冷冻、Glucose-EDTA解冻液解冻的精液,体外受精后的囊胚发育率(17.6%)与鲜精体外受精囊胚率(17.9%)无显著差异,但二者均显著低于孤雌激活对照组的囊胚率(36.6%)(P<0.05).由此可知:干冰颗粒法冷冻结合Glucose-EDTA解冻液解冻是较为理想猪精液冷冻保存方法,经该方法冷冻、解冻的猪精液,体外受精后的胚胎发育率与鲜精没有显著差异.     

人类低品质精液的一步冷冻保存

男性不育症有部分病因是由于低品质精液因素所致,对这类精液进行冷冻保存有助于临床结合生殖工程技术实施治疗。近年人类精液冷冻保存方法学有了很大进展,但低品质精液体外处理结合一步冷冻的效果尚无报道。低品质精液按照其低精子参数分成3组：1组（低精子计数组,n二6）,11组（低精子活动率组,n＝11）,皿组（低正常精子形态率组,n＝8）。1组用BWW生理液洗涤、离心制备成精子悬液。3组的精子悬液与冷冻保护剂等量混匀后吸人IInL聚丙烯注射器,直接置一196T一步冷冻和保存。经体外处理精子后的3组标本,解冻后的精子复苏率分别为（…     

波尔山羊冷冻精液稀释液配方研究

实验采集三头波尔山羊种公羊精液,比较三种精液(A.葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄;B.葡萄糖-柠檬酸钠-乙二胺四乙酸-卵黄;C.乳糖-卵黄)冷冻保存稀释液配方对颗粒冻精解冻效果,以及测定解冻后精子活力,结果表明:C稀释液解冻后精子的存活率平均为35.4%,优于A和B液呈现显著差异或极显著差异(P＜0.05,P＜0.01),而且C液的解冻后的存活时间为58.75h,高于A和B液,差异极显著(P＜0.01).结论:C的稀释液配方是最优的颗粒解冻配方.     

运用计算机辅助分析检测超低温保存的真鲷(Pagrosomus major)精子的质量

采用电脑辅助分析(CASA)检测二甲基亚砜(DMSO)作为抗冻剂超低温保存的真鲷精子运动特征及总运动率与受精率、孵化率的关系.以12%-21%DMSO作为保护剂超低温保存2周的精子解冻激活10 s后,运动精子百分率与鲜精的没有显著的差异,而且超低温保存过程没有明显的改变其运动速度和运动方式.然而超低温保存却显著地降低了冻精运动持续的时间,激活后30 s冻精总运动率显著低于鲜精,激活后60 s降至(52.1±9.2)%.我们以标准化的最佳精卵比500∶1对超低温保存的精子进行人工授精实验,发现冻精总运动率与受精率(r=0.869)、孵化率(r=0.826)呈显著的正相关.实验结果显示CASA系统可以客观地检测超低温保存的真鲷精子质量,进一步证明了CASA在精子质量检测中简单、快速、准确的优点,因此该方法在鱼类精子超低温保存研究中具有广阔的应用前景.     

人类精子的冷冻生物学特性

人类精子的冷冻保存，精子要经历与冷冻保护剂孵育、降温冷冻、超低温贮存和解冻复温等过程，这过程的化学和物理效应直接作用于精子，精子功能不可避免地受到影响。本研究应用多种方法探讨人类精子的冷冻生物学特性。精子活动率和活力采用Malker精子计算器测定（n=150），精子膜完整性应用低渗膜肿胀试验（n＝60），精子体外存活用培养法观察（n＝8），精子ATP含量用LKB荧光测定仪检测（n＝55），精子穿透宫颈粘液能力采用Kremer试验评估（n＝42），精子受精能力借助去透明带地鼠卵穿透试验检测（n＝30）。精子冷冻采用程序控制生物冷…     

大黄鱼精子冷冻复苏后活力和超微结构的变化

大黄鱼精子以甘油为冷冻保存剂,经冷冻-解冻复苏后观察精子的活力和超微结构变化,并进行人工授精,观察冻精的受精能力.实验结果表明,冷冻精子的活力较高(83.1±6.2)%.大部分冷冻精子结构完整,进行人工授精可以获得较高的受精率(71.5±11.6)%.与鲜精对照组比较,仍存在差异(P<0.05).部分冷冻-解冻后的精子结构出现异常,畸形率达到29.3%(P<0.01).较常见的异常是精子质膜膨胀或破损,核膜消失,染色质解体,线粒体嵴消失,轴丝断裂成许多段等.冷冻精子结构异常可能是冻精解冻复苏后精子活力和受精力下降的主要原因.     

人类精液一步冷冻法的研究

自Sherman（1963）成功创立液氮冷冻保存人类精液以来,人类精液的冷冻普遍应用程控冷冻仪或人工操作的多步控制降温方法,对将精液从室温直接置-196℃液氮冷冻保存的“一步冷冻法”,迄今报道和评价尚少。本文选用聚丙烯1mL注射器作精液冻贮容器,实验建立一种简便有效的人类精液一步冷冻方法。冷冻保护剂以BWW精子培养液为基液,添加入10％体积比甘油、甘氨酸、蔗糖和人血清白蛋白等制备而成。精液冻贮容器为聚丙烯一次性使用的IInL注射器。精液与冷冻保护剂等体积混匀后,直接投入一196T液氮“一步冷冻”和保存。解冻为37℃水浴5ban…     

大熊猫电刺激采精及精液冷冻保存研究

对卧龙自然保护区大熊猫研究中心的９只５．５－１６．５岁的雄性大熊猫进行了１７次电刺激采精,其中３只是能进行自然交配并繁殖了后代的种公兽,比较研究了精液离心、不同稀释液和冷冻方法对大熊猫精液超低温冷冻保存后的活力、运动状态、精子和顶体形态的影响。细冷冻是１种较好的超低温冷冻精液的方法。     

奶牛胚胎简易快速冷冻及其移植试验研究

将7日龄的黑白花奶牛胚胎,采用简易冷冻仪,以液氮作冷冻源的快速冷冻、解冻法对胚胎进行冷冻.甘油作冷冻保护剂,以1℃/min的速度由室温降至-7℃,在-7℃下绣发结晶,并在-7℃下维持5分钟;又以0.3℃/min降到-10℃,最后以0.5℃/min速度降至-30℃,平衡10分钟后,胚胎直接投入液氮罐申保存。需移植时,直接在37℃温水中解冻。本试验解冻了25枚胚胎,取1,2级胚胎15枚,除去甘油后,将15枚胚胎用凯氏枪输卵器分别移植给15头同期受体的的母牛,现已产下3头牛犊.结果表明,采用简易冷冻仪、以液氮作冷冻源的快速冷冻、解冻的胚胎可以成活,且有利在生产实践中推广应用。     

七叶树种子离体胚的超低温保存

通过对七叶树种子离体胚超低温(-196 ℃)保存后生活力、相对电导率和脱氢酶活性的测定分析,初 步研究其长期保存的可行性。结果表明：含水率是影响七叶树种子离体胚超低温保存的重要因素,超低温 保存时应对种子进行适度脱水。超低温保存后,七叶树离体胚生活力最高为93 %,其处理组合中57.3 %含 水率+缓速冷冻+快速解冻+10 %二甲基亚砜+10 %蔗糖+20 %聚乙二醇为最佳处理方案。     

不同贮藏方法对桂花花粉活力影响的研究

研究不同贮藏方法对桂花花粉活力的影响,探索桂花花粉保存的适宜条件。以4个品种群中的9种桂花品种为试验材料,对其进行常温、低温、低温冷冻和超低温冷冻贮藏,并对不同贮藏时间内的花粉活力进行检测。结果表明:桂花花粉在10%的蔗糖、0.01%硼酸和1%的琼脂糖组成的固体培养基上,25℃恒温培养24 h后花粉基本充分萌发,可用于萌发率的统计;光照和黑暗对花粉萌发无显著影响。不同贮藏条件下花粉保存效果差异显著,室温条件(15~20℃)下,大多数品种花粉寿命为15~20 d;低温贮藏(4℃)花粉活力可延长至50 d,低温冷冻(-20℃)和超低温冷冻(-70℃)贮藏100 d后大多数桂花品种的花粉萌发率差异不显著。在低温冷冻和超低温冷冻条件下桂花花粉活力下降较慢,可用于花粉较长时间的保存。     

北极狐精液冷冻和解冻对精子活力的影响

对9－10月龄的后备北极公狐的精液进行了冷冻观测,结果表明：I号稀释液经冷冻保存（－196℃）3年,其解冻活率达45％．5％葡萄糖作为解冻液明显好于葡－柠解冻液,2．9％柠檬酸钠液不适于北极狐冷冻精 液,干解冻优于湿解冻。     

细胞松弛素B、温度、离心处理对猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻的影响

主要探讨使用CB预处理和不同温度冷冻保护剂对猪卵母细OPS玻璃化冷冻保存的影响,并对使用不同温度冷冻保护剂下,探讨离心猪卵母细胞后的OPS冷冻、解冻的效果.结果表明,体外成熟培养12h后,将经7.5μg/mL细胞松弛素B(CB)处理的猪卵母细胞进行OPS玻璃化冷冻保存.解冻后继续体外成熟培养,猪卵母细胞的形态正常率和成熟率与对照组无显著差异(P>0.05),但是与对照组相比,经冷冻前经CB预处理的卵母细胞其体外受精胚胎的卵裂率、桑葚胚和囊胚率显著提高(P<0.05).此外,使用预平衡至39℃的冷冻保护剂能够达到较好的解冻效果,卵母细胞成熟率较高,但离心并没有促进冷冻后猪卵母细胞体外受精胚胎发育率.     

运用计算机辅助分析检测超低温保存的真鲷（Pagrosomus major）精子的质量

采用电脑辅助分析（CASA）检测二甲基亚砜(DMSO)作为抗冻剂超低温保存的真鲷精子运动特征及总运动率与受精率、孵化率的关系.以12%—21% DMSO作为保护剂超低温保存2周的精子解冻激活10s后，运动精子百分率与鲜精的没有显著的差异，而且超低温保存过程没有明显的改变其运动速度和运动方式.然而超低温保存却显著地降低了冻精运动持续的时间，激活后30s冻精总运动率显著低于鲜精，激活后60s降至（52.1±9.2）%.我们以标准化的最佳精卵比500∶1对超低温保存的精子进行人工授精实验，发现冻精总运动率与受精率（r=0.869）、孵化率（r=0.826）呈显著的正相关.实验结果显示CASA系统可以客观地检测超低温保存的真鲷精子质量，进一步证明了CASA在精子质量检测中简单、快速、准确的优点，因此该方法在鱼类精子超低温保存研究中具有广阔的应用前景.