胎儿左右大脑差异表达基因片段的克隆

应用抑制性消减杂交（ＳＳＨ）技术从一２４ 周流产男性胎儿的左右大脑ｍ ＲＮＡ 中克隆到了４２ 个左脑特异表达基因的ｃＤＮＡ 片段，并随机挑选１５ 个克隆的测序结果与美国ＮＩＨ 基因库ＥＳＴ进行了同源性分析，同源性范围是６４％ ～１００％ ，其中有５ 个克隆的基因库同源序列与脑有关，其余１０ 个克隆同源于脑以外的其它组织．     

水稻矮化突变体差异表达cDNA片段的克隆与分析

利用抑制性消减杂交（Suppressive subraction hybridization,SSH）分离本实验室获得的一株水稻矮化突变体dwarf69与其野生型对照品系特光矮-2（Rryza sativa,TGA-2 indica）间表达有差异的cDNA片段,分别以dwarf69作为驱赶子,TGA-2为检测子,以及以dwarf69作为检测子,TGA-2为驱赶子建立了两个差异表达cNDA文库,分别代表在TGA-2和dwarf69中特异表达的cDNA,经反式Northern检测这两个文库共得到10个阳性克隆。     

食管癌表达上调基因EC45 cDNA的克隆

鉴别食管癌中差异表达的基因.利用抑制削减杂交和反式Northern高密度点杂交相结合的方法,获得一个在70%(18/26)食管癌中表达显著上调的基因,命名为EC45.通过放射杂交技术将其定位于3p12-3p11.2.通过筛选食管癌cDNA文库获得全长EC45cDNA(1987bp).EC45编码204个氨基酸,与核糖体蛋白l15的开放阅读框100%同源,但与5'非翻译区和3'非翻译区均无同源性.16种正常成人组织Northern杂交显示EC45均有表达,其转录本大小为2.0kb.以上结果提示:编码核糖体蛋白L15的EC45基因在食管癌组织中表达上调,在食管癌发生发展过程中可能发挥作用.     

盐胁迫下盐藻特异表达基因片段的克隆

盐碱、干旱、极端温度等逆境条件是影响植物生长的重要因素。以抑制消减杂交及差式库的筛选对盐藻（Dunaliella salina)在高渗胁迫下特异表达基因片段进行了克隆。比较长期（1周,LS）及短期（16h,SS)NaCl胁近条件下基因表达情况,前者克隆到2个特异表达片段,后者也有2个。通过测序及Gene Bank中进行同源搜索,均未有可靠的同源性结果。可以初步认为,以上得到的4个cDNA可能是新基因或此片段不在保守区内。     

RBM13 cDNA的克隆及其表达谱分析

从人胎脑cDNA文库中克隆到一条长3479bp的cDNA,它含一个长903bp的开放阅读框架,拟编码一个300个氨基酸的蛋白质,其分子质量为35397u,等电点为5．35,与酵母MAK16蛋白的同源性为41％,该编码蛋白有一个双侧核定位信号motif和一个RNA结合motif,将这一新cDNA序列推导的蛋白命名为RNA结合基序蛋白13（RBM13）,基因定名为RBM13,用RBM13基因的cDNA探针进行Northern杂交,检测到3．6kb和2．2kb二种长度的转录本。在心脏,骨骼肌,肾脏和肝脏中有较高表达。     

褐飞虱羧酸酯酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱羧酸酯酶基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为396 bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自铜绿蝇、家蝇、沟鼠、黑腹果蝇、线虫和埃及伊蚊的羧酸酯酶的片段存在高度同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,羧酸酯酶基因表达水平明显升高.以上结果表明,羧酸酯酶基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在有毒化学物质解毒及增强褐飞虱对抗性水稻的耐受性方面可能起着重要作用.     

褐飞虱谷胱苷肽转移酶基因cDNA片段的克隆、测序及表达分析

谷胱苷肽转移酶是昆虫体内重要的解毒酶系之一，研究水稻害虫褐飞虱的谷胱苷肽转移酶基因在褐飞虱与水稻互作中的表达变化，可为有效防治褐飞虱提供新的理论依据。利用反转录多聚酶链式反应（RTPCR）技术克隆了褐飞虱谷胱苷肽转移酶基因编码区的eDNA片段，并使用Northern杂交技术检测了该基因对两种不同抗性水稻的分子反应。结果表明，所克隆到的eDNA片段长度为201bp，该片段所编码的氨基酸序列与来自大劣按蚊、细小按蚊、冈比亚按蚊、果蝇和木瓜果实蝇的谷胱苷肽转移酶的片段存在高度同源性。Northern杂交显示，在褐飞虱取食抗性水稻后，谷胱苷肽转移酶基因表达水平明显升高，但褐飞虱取食感虫水稻TN1后，该基因的表达水平没有明显变化。     

穿山龙液泡H+-ATPase c亚基基因片段的克隆

利用抑制消减杂交（SSH）和SMART技术，构建了3年生和1年生穿山龙（Dioscorea nipponica）根组织mRNA群体间正向差减cDNA文库．从34个随机测序的cDNA克隆中，发现了1个编码液泡H^＋-ATPase（V-H^＋-ATPase）c亚基的克隆，并命名为DnvHAc1（Accession No：DN792564）．序列同源性分析表明，其cDNA序列长486bp，3’端具有PolyA结构，其编码的氨基酸序列（115个氨基酸残基）也与多种植物的液泡H^＋-ATPase c亚基（16kDa proteolipids）具有较高同源性，具有3个跨膜疏水结构域，结构域Ⅲ为功能保守的区域，有dicyclohexylcarbodimide（DCCD）结合位点，Glu-92在调节液泡H^＋-ATPase具有重要作用．该研究结果为克隆其全长基因和进一步研究其在薯蓣皂甙次生代谢生物合成中的功能提供了重要的实验基础．     

褐飞虱细胞色素P450基因cDNA片段的克隆、测序及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱细胞色素P450基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为237bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自烟草天蛾、棉铃虫、埃及伊蚊、家蝇、黑腹果蝇和线虫的CYP6家族的P450的氨基酸序列存在同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,P450基因的表达水平明显升高.以上结果表明,P450基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在褐飞虱对抗性水稻的耐受性和解毒方面可能起着重要作用.     

褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kDa亚基cDNA片段的克隆及表达分析

NADH泛醌氧化还原酶是动物体内呼吸链电子传递系统的第一个酶，克隆水稻害虫褐飞虱的NADH泛醌氧化还原酶基因，及研究其在褐飞虱与水稻互作中的表达变化，将为科学防治褐飞虱提供新的线索。利用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术克隆了褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kDa亚基基因的cDNA片段，并进行了序列测定；使用NoRhem杂交技术检测了该基因对两种不同抗性水稻的分子反应。分子杂交结果表明，在取食抗性水稻品种B5后，褐飞虱的NADH泛醌氧化还原酶51kDa亚基基因表达水平明显升高，而取食感虫水稻TN1后，该基因的表达水平没有明显变化。     

喜旱莲子草及鸭趾草对重金属的富集实验研究

研究喜旱莲子草(Alternanthera philoxeroides)与鸭趾草(Commelina communis)在Vb^2 、Zn^2 、Cd^2 、Cr^2 、Cu^2 5种重金属胁迫下的生长变化，通过测量根长得到了抑制率．并利用原子吸收测得富集量和富集系数．研究发现：喜旱莲子草对Zn^2 、Vb^2 的富集效果较好，水培条件下富集系数最大分别能达到94．8、21．4；鸭趾草对Pb^2 的富集效果较好；砂培条件下富集系数最大能达到76．0．     

重金属镉处理的水稻幼根cDNA抑制差减杂交文库的构建

重金属污染是影响水稻生长和稻米品质的重要因素,其中又以镉(Cadmium,Cd)污染最为严重,然而目前对其分子机制以及解决措施却了解甚少。本研究以水稻品种日本晴为材料,采用0.5 mmol/L镉处理水稻幼根48 h,通过运用结合分子镜像选择(mirror orientation selection,MOS)技术的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)方法,构建cDNA抑制差减杂交文库,并进行microarray筛选,用于分离应答镉胁迫的差异表达基因。揭示水稻应对镉胁迫处理的分子机理,为水稻耐受镉胁迫基因的分离奠定了基础。     

硬叶兜兰花芽SSH文库的构建

以硬叶兜兰花芽cDNA为Tester,营养芽cDNA为Driver,利用SMART策略构建了硬叶兜兰花芽的抑制性消减杂交(SSH)文库.通过PCR对文库中插入的片段进行检测后,筛选了288个插入片段为500bp以上的克隆进行测序.测序结果去除载体序列后聚类得到18条差异表达片段,用BLAST进行比对分析表明,这些差异表达基因所编码的蛋白与光合作用、合成代谢、基因调控等功能有关,其中包括多个转座子和反转录转座子的同源基因.     

抑制性扣除杂交(SSH)技术原理及在水稻基因表达差异分析中的应用

抑制性扣除杂交法运用了杂交二极动力学和链内退火优先于链间的原理，使原丰度有差别的单链cDNA相对含量基本一致，使非目的片段两端反向重复序列退火时产生“发卡”结构，不能与引物配对，从而选择性地抑制了非目的片段扩增。该方法假阳性率低，灵敏度高，在水稻基因表达差异分析中有着广泛的应用。     

根瘤菌87-1-1诱导刺槐根表皮传递细胞特异性表达的cDNA文库构建及序列分析

探寻根瘤菌诱导刺槐后根表皮细胞分化成传递细胞的特异性表达基因及其分子机制.采用抑制差减杂交(suppression subtraction hybridization,SSH)技术构建刺槐根系被接种根瘤菌和未被接种根瘤菌二者间的正反两个c DNA文库.各挑选正反文库中500个克隆进行测序,在Blastn、Blastp、Swiss Prot、KEGG、COG、Interpro以及Gene ontology(GO)数据库中进行比对注释.结合生理过程对ESTs进行分析,共获得725条非冗余序列(uni EST),正反向文库分别为385条和340条,其中包括674个单一序列(singlets),51个拼接序列(contigs).在Nt库比对中有674条uni ESTs与已知基因匹配,占比93%;在Nr库比对中有648条序列有匹配蛋白,占比89%.有正向文库213个uni ESTs和反向文库156个uni ESTs能进行Geney ontology(GO)功能注释,在细胞组分被注释了270次,分子功能被注释了448次,生物过程被注释了484次.uni ESTs的功能分析显示,正向文库中多与细胞翻译后修饰、转录因子、细胞信号通路、细胞壁/细胞膜/内膜系统以及细胞骨架相关蛋白有关,部分是结瘤相关基因.而反向文库中与细胞生长、代谢物形成的基因相关较多,这与根瘤菌处理刺槐后的生理过程一致.在根瘤菌诱导的刺槐根组织文库中发现特异性基因如MYB类转录因子、囊泡相关膜蛋白等与传递细胞相关的基因,结果有助于进一步研究此类传递细胞的形成分化机制.     

抑制性差减杂交筛选差异表达基因方法初探

抑制性扣除杂交技术是一种基因我隆的新方法,它对研究细胞生殖,发高效能 ,分化,癌变,衰老及程度化死亡吸关基因的差异表达以及相关基因的分子克隆提供了有力的工具,结合进行 的用SSH法筛选与砷代谢相关的实验,主要介绍了抑制性扣除杂交技术的主要原理,基本过程,优越性,主要缺陷及目前最新的研究进展。