叶绿体ATP合酶CF1与CF0亚基间的相互作用

通过PCR的方法得到波菜叶绿体ATP合酶9个亚基的编码序列,分别克隆到质粒pGBT9和pGAD424,双转化入酵母菌株HF7C和SFY526,用酵母双杂交系统检测菜叶绿体ATP合酶各亚基间的相互作用,同时用双杂交系统和体外结合实验检测γ亚基与ε亚基及ε亚基突变体ε△N21,ε△C45之间的相互作用,实验结果基本上支持目前关于细菌ATP合酶的结构模型,与之不同是,δ亚基与β,γ,ε以及CF0的Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ亚基均有作用,这些说明尽管叶绿体ATP合酶与细菌ATP合酶有着类似的亚基组成和空间结构,但在亚基间的相互关系和催化过程中的构象变化上可能有所不同。     

叶绿体ATP合酶CF_1与CF_0亚基间的相互作用

通过PCR的方法得到菠菜叶绿体ATP合酶9个亚基的编码序列, 分别克隆到质粒pGBT9和pGAD424, 双转化入酵母菌株HF7C和SFY526, 用酵母双杂交系统检测菠菜叶绿体ATP合酶各亚基间的相互作用. 同时用双杂交系统和体外结合实验检测 g 亚基与e亚基及e亚基突变体eDN21, eDC45之间的相互作用. 实验结果基本上支持目前关于细菌ATP合酶的结构模型. 与之不同的是, d 亚基与b, g, e 以及CF0的Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ亚基均有作用. 这些结果说明尽管叶绿体ATP合酶与细菌ATP合酶有着类似的亚基组成和空间结构, 但在亚基间的相互关系和催化过程中的构象变化上可能有所不同.     

外电场对叶绿体毫秒延迟发光的增强效应与膜内外质子梯度的关系

我们以前报道的研究结果表明,外加交变电场,诱导叶绿体的毫秒延迟发光(简写msDLE)的增强。这一增强效应是由于外电场诱导叶绿体功能膜内外的电位差的增加所导致。Barber和Jursinic等的报道指出,盐差度诱导的膜电位或光诱导的膜电位增强延迟发光必须有膜内外质子梯度的预先存在。徐春和等的实验结果表明,毫秒延迟发光的快相受质子浓度差的影响。那么,外电场诱导的膜电位增强msDLE的效应与质子梯度有怎样的关系,弄清这一问题是本文研究的目的。     

大肠杆菌质子ATP酶复合体(F_1F_0)中ε亚基突变对酶的生化性质的影响

大肠杆菌(Escherichia coli)质膜上的质子ATP酶(H~+-ATPase)由F_1、F_0二部分组成,纯化的F_1ε亚基对F_1有很强的抑制作用,但在重组F_1F_0中似乎不显现抑制作用。1986年Gibson实验室分离到一种ε亚基突变株,并得到二种部分回复突变株,实验结果表明,突变株中的F_1F_0仍能形成,但水解活力及跨膜质子传递能力均下降,而在部分回复突变     

喷洒低浓度亚硫酸氢钠可促进小麦叶片光合磷酸化和光合作用

用１～２ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＳＯ３喷施于小麦叶面,可以提高叶片的光合速率,并能持续３ｄ左右。左此条件下,光下叶片中的ＡＴＰ含量提高,叶片的毫秒延迟发光加强,反映与光合磷酸化活力有关的跨类囊体膜质子样度增加。将书知可促进循环光合磷酸化的辅助因子ＰＭＳ和ＮａＨＳＯ３分别和共同喷洒叶片,次日所有叶片的光合速率均比对照（喷水）提高２０％左右。共同自理未出现叠加效应,表明ＨａＨＳＯ３的主要作用和ＰＭＳ促进光     

大豆叶片状态转换过程中跨膜质子动力势的变化

用毫秒延迟发光(ms-DLE)研究大豆叶片在状态转换过程中跨膜质子梯度的变化情况. 用弱远红光诱导大豆叶片向状态Ⅰ转换时, 叶绿素室温荧光F_m/F_o和77K荧光F ₆₈₅/F₇₃₅基本不变, ms-DLE快相强度仅受到轻微促进. 用弱红光诱导叶片向状态Ⅱ转换时, F _m/F_o和F₆₈₅/F₇₃₅均呈先迅速下降再转向稳定的趋势, F_m/F_o下降的速度较F₆₈₅/F₇₃₅快; ms-DLE快相强度则是先迅速上升, 接着逐渐下降, 用去除质子梯度的解耦联剂尼日利亚菌素(nigericin)处理后, 快相强度的上升再下降的变化明显地受到抑制, 而用去除膜电位的缬氨霉素(valinomycin)处理后无显著影响. 这表明向状态Ⅱ转换时, ms-DLE快相强度的迅速上升主要与PSⅡ氧化水时向膜内侧释放的质子数量有关.     

荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复

利用GPS-LS接点扫描系统, 在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15 bp (即编码5个氨基酸短肽)的外源片段, 建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库. 利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799对突变体库进行功能互补筛选, 测序后确定了12个可以忍受5个氨基酸插入的位点, 其中位点F295/T296经Ssp DnaE内含肽(intein)介导的蛋白互补技术鉴定为可拆分和蛋白重建的位点. 从位点F295/T296将G2-EPSPS基因一分而二, N-端和C-端片段分别连接在携带Ssp DnaE 内含子元件的原核表达双质粒上, 获得共转化质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC. 将质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC分别或共转化内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799中, 携带共转化质粒的重组子能够在M9限制性培养基生长, 而携带单一质粒的不能生长, 表明从位点F295/T296拆分的aroA基因在内含肽介导下实现了蛋白重建, 在突变株ER2799中恢复了5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性, 酶活水平达到野生型的62.92%,为4.48 U/mg.     

与光系统Ⅱ颗粒结合的蛋白酶的初步分析

叶绿体是植物进行光合作用的细胞器,光合作用中光能的吸收、传递和转化、水的裂解及光合磷酸化等功能均是在具有一定分子排列和空间构象并镶嵌于类囊体膜上的叶绿素蛋白复合体中进行的。叶绿体类囊体膜蛋白的周转需要多种蛋白酶的水解作用。在蛋白质合成后加工成熟中,已证实光系统Ⅱ(PS Ⅱ)反应中心D1蛋白(Q_B结合蛋白)的C-末端加工需要一个类囊体膜结合的蛋白酶,质体菁N-末端加工也需要一个类囊体结合的蛋白酶,与PSⅡ水裂解相关联的三种外在性水溶性蛋白如同Cyt.b-f在整合到膜上时需要类囊体膜结合     

通过叶绿体基因工程在烟草中合成中长链羟基脂肪酸聚酯

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs)属于微生物聚酯. PHA合酶(PHA synthase, 由phaC基因编码)和3-羟酰基-酰基转移蛋白-辅酶A转移酶(3-hydroxyacyl-acyl carrier protein-coenzyme A transferase, 由phaG基因编码)是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶. 以aadA(氨基糖苷-3′-磷酸转移酶)基因做筛选标记, 分别构建了含phaC2基因的单价叶绿体转化表达载体pTC2以及同时嵌合phaC和phaG基因的双价叶绿体转化表达载体pTGC. 通过PDS1000/He基因枪转化法转化烟草, 获得具有壮观霉素抗性的叶绿体型转基因烟草植株, PCR和Southern Blot结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中且基本达到同质化. 气相色谱法检测转基因株系中的mcl-PHAs含量最高达4.8 mg/g干重, 合成的PHAs单体主要成分为3-羟基辛酸(3-hydroxyoctanoate, 3-HO)和3-羟基癸酸(3-dydroxydecanoate, 3-HD). 透射电子显微镜观察到转基因烟草叶片叶绿体中确有PHAs颗粒累积.     

衣藻细胞色素b559 α 亚基Ser24残基定点突变影响PSⅡ光合放氧活性

为研究细胞色素b₅₅₉ (Cyt b₅₅₉)在光合系统中的功能, 采用大引物定点突变技术, 将衣藻叶绿体Cyt b₅₅₉ α亚基(psbE基因编码)中与组氨酸(His²³)相邻的氨基酸残基丝氨酸(Ser²⁴)定点突变为苯丙氨酸(Phe), 获得突变体S24F. 对突变体的生理生化分析表明, S24F既能进行光合自养也能进行光合异养, 但是在自养和异养条件下, 其生长速率比对照慢; S24F的PSⅡ放氧活性约为野生衣藻细胞的71%, S24F的光系统Ⅱ(PSⅡ)光化学效率F_v/F_m比野生型对照低约0.23. 此外, 相比野生型对照, 突变体S24F对强光更加敏感; SDS-PAGE和Western杂交的结果表明, 对Cyt b₅₅₉ α亚基中Ser²⁴的定点突变影响了Cyt b₅₅₉ α亚基及其他膜蛋白, 如LHCⅡ和PsbO等的表达. 上述结果说明, 虽然Ser²⁴残基并不参与血红素配位, 但其对维持PSⅡ的活性具有重要作用.     

猪心线粒体可溶性ATP酶(F_1)与H~+-ATP酶复合体(F_0·F_1)的Arrhenius图比较

线粒体H~+-ATP酶是一个很复杂的复合体,位于线粒体内膜,是偶联磷酸化的关键装置。它具有催化ATP合成和ATP水解的双重功能。H~+-ATP酶复合体由三部分组成:位于膜外的可溶性头部(F_1)、嵌在膜内疏水区的基部(F0)及联系F_1和F_0的柄(OSCP)。其中可溶性F_1是H~+-ATP酶的催化活性部分,当它从膜上分离下来后,虽然不再能催化ATP合成,仍具有水解ATP的功能。但对抑制剂寡霉素不敏感,对冷不稳定。当F_1与F_0和膜脂重新结合形成H~+-ATP酶复合体之后,催化ATP水解的活性又具有对抑制剂寡霉素的敏感性和对冷稳定性的性能。     

Chk1 C 末端调控结构域对其在DNA 损伤后的核定位及修复活性的影响

DNA 损伤效应激酶Chk1 是一种在进化过程中高度保守的蛋白激酶, 它是联系DNA 完整监控器和细胞周期引擎的关键介导蛋白. 通过对一系列GFP 标记的Chk1 调控结构域缺失突变体细胞核定位变化分析, 发现Chk1 C 末端调控结构域中的34 个氨基酸残基(334~368)参与了调控损伤诱导的Chk1 核积累. 同时通过构建Chk1 及不同Chk1 调控结构域缺失突变体的pXJ41 重组质粒, 并与报告质粒pEGFP-N2 共转染HeLa 细胞, 研究不同Chk1 调控结构域缺失突变体的DNA 损伤修复能力, 同时检测了不同Chk1 调控结构域缺失突变体对细胞周期的影响, 并通过Western blot 检测Chk1 下游靶标Cdc25C 的磷酸化情况进行了Chk1 缺失突变体激酶活性分析. 结果显示, C 末端缺失108 个氨基酸残基(368~476)的CΔ368 活性高于全长Chk1,并且其过表达可诱导细胞G1/S 期阻滞, 延迟细胞周期进程. C 末端缺失142 个氨基酸残基(334~476)的CΔ334 活性与全长Chk1 相当, C 末端缺失188 个氨基酸残基(288~476)的CΔ288几乎没有酶活性, 说明调控结构域包括抑制和激活元件. 通过本研究对Chk1 的功能有了新的更为深入的认识.     

一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.     

植物NAD-IDH基因克隆及体外表达酶活力分析

植物NAD⁺-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)是一多功能酶. 以拟南芥生态型“Columbia gl1”及甘蓝型油菜三系“陕2A”, “陕2B”和“垦C1”的叶片为材料, 采用RT-PCR方法成功地从每种植物材料中分别克隆了3种NAD-IDH不同亚基基因. 同源性搜索发现, 来源于油菜的克隆基因是新基因. 将克隆基因的功能蛋白编码区整合到pMID1多克隆位点, 构建表达重组体, 均能在体外翻译系统中高效地表达出特异目的蛋白. 亚基0, 亚基1和亚基2基因转录本加入到含终浓度为36 μg/mL的二硫键异构酶的体外翻译系统, 体外表达产物中检测到NAD-IDH酶活力. 不同基因种类及转录本分子比的体外表达产物的酶比活力比较表明, NAD-IDH由3种亚基组成, 缺一不可, 缺少亚基0是致命的, 缺少亚基1或2中的任何一个对酶活力的损伤是严重的. 同时发现, 来源于陕2A和陕2B的亚基1基因转录本中存在碱基缺失现象, 从而发生移框突变或无义突变, 使突变亚基不表现正常亚基1功能, 导致油菜品系间叶片NAD-IDH酶比活力存在差异.     

猪心线粒体可溶性ATP酶(F_1)的结晶

线粒体内膜H~ -ATP酶是一个酶复合体,其重要的生理功能不仅是参加氧化磷酸化中的ATP合成,并且也参与了依赖于ATP的一些功能如二价阳离子的摄取,NADP~ 的还原及电子流的逆转等.F_1是H~ -ATP酶的具有催化活力的部分,自1960年以来有很多方法来分离提纯不同来源的F_1。近年来还得到了F_1的结晶,这样通过电镜与X-光衍射技术对该酶结构的进一步研究开辟了一条途径,也有助于氧化磷酸化作用的分子机制的阐明。已得到的F_1结晶有耐热菌的TF_1牛心F_1与鼠肝F_1.     

水疱性口炎病毒L蛋白N端存在新的定位信号

水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV) L蛋白是该病毒复制酶的主要成分, 分子量约为241 kD. 通过构建L蛋白缺失突变体与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的方式, 将融合蛋白置于T7启动子或CMV启动子下游, 在多种动物细胞中瞬时表达了重组的融合蛋白. 荧光显微镜观察结果显示, 仅保留N端96个氨基酸残基或缺失N端120个以上残基时, 融合蛋白均匀分布于整个细胞质中, 而含有N端120个以上残基时, 融合蛋白呈点状或局部分布于核周围部位. 截取L蛋白96～120氨基酸片段, 连接到GFP蛋白氨基端, 同样融合蛋白亦特异性地分布到核周围局部区域. 进一步研究含定位信号的25个残基片段发现, 仅13个残基的肽段QGYSFLHEVDKEA(108 ~ 120)就具有定位功能, 缺失D或V均导致定位信号完全丧失. 含有这13个残基的GFP融合蛋白, 在多种细胞和不同表达模式下均显示了同样的分布规律, 表明L蛋白N端这种定位信号具有独立的定位功能, 并且在不同细胞中是保守的.     

磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)氢酶基因功能分析及对细胞生长的影响

探讨了磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1)氢代谢与细胞生长、磁小体合成之间的关系. 分别构建了吸氢酶大亚基基因hupL缺失突变株L206和氢酶大亚基基因hyaB与hupL的双缺失突变株B206. 比较了野生型菌株与突变株在摇瓶培养条件下的吸氢量、放氢量、细胞生长曲线和铁的吸收, 并结合电子显微镜观察了细胞内磁小体合成情况. 结果表明, 磁螺菌HupSL为专一性的吸氢酶, HyaAB为专一性的放氢酶; L206在磁小体合成过程中的放氢量相对较高, 其生长速度、铁吸收速度明显快于MSR-1及B206. 推测磁螺菌可通过上述吸氢酶和放氢酶的作用适当调节细胞内还原力的平衡, 促进铁的吸收和磁小体合成.     

优系青蒿法呢基焦磷酸合酶基因的克隆和酶学分析

从青蒿(Artemisia annua L)高产株系025的cDNA文库中克隆到了一个编码青蒿法呢基焦磷酸合酶(AaFPS1)的cDNA(af1). 序列分析表明, 这一cDNA编码一个含343个氨基酸残基的蛋白质, 分子量为39 kD. 推导出的氨基酸序列与来自其他植物、哺乳动物及酵母的FPS相似, 也包含异戊烯基转移酶和聚异戊烯基合酶所共有的5个保守域. 此cDNA在大肠杆菌中的表达产物表现出明显的FPS酶学活性. 通过离子交换层析纯化后, 进一步测定了其酶学动力学. 上述结果将进一步推动青蒿素生物合成分子调控的研究.     

异烟酸酰肼对衣藻硝酸还原酶活力的影响

高等植物和绿藻的硝酸同化和CO_2固定两个基本同化过程的关系十分密切。参与硝酸同化的四个酶有三个定位在叶绿体中,两者都利用光反应产生的还原力,并通过对ATP和碳骨架和氨基酸的供求相互沟通。但对碳氮同化的相互调节研究还不多,已有的两种调节假说似乎都认为光呼吸起着重要的调节作用。本文报道光呼吸抑制剂异烟酸酰肼(INH)对硝酸同化的关键酶硝酸还原酶(NR,ECl,6,6,2)活力的促进作用。     

强光照处理菠菜叶片产生的交联聚合物中D1蛋白部分发生磷酸化

利用D1蛋白特异性抗体, 在强光照(800~2500 μmol photons·m^-2·s^-1)处理3 h的菠菜叶片类囊体膜中检测到4种D1蛋白聚合物, 它们的相对含量与处理时光照强度相关. 进一步分析表明, 70 kD聚合物为D1蛋白与CP43交联产物, 65和60 kD聚合物是D1蛋白与D2蛋白交联产物, 41 kD聚合物是D1蛋白与细胞色素b₅₅₉ α亚基交联物. 1000 μmol photons·m^-2·s^-1光照处理生成的D1/Cyt b₅₅₉聚合物最多, 光强增加时其含量下降. 磷酸化苏氨酸抗体Western blot分析结果显示, D1/Cyt b₅₅₉和D1/CP43聚合物中存在磷酸化蛋白; 外加磷酸酯酶处理后, 磷酸化的D1/Cyt b₅₅₉和D1/CP43聚合物减少. 上述结果表明, 强光照处理叶片引起D1蛋白与其他PSⅡ核心蛋白交联, 所生成的聚合物中部分D1蛋白以磷酸化形式存在.