基因重组人骨形成蛋白4成熟肽在大肠杆菌中的大规模发酵表达及纯化

含有编码人骨形成蛋白4成熟肽(Bone morphogenetic protein 4 mature peptide,hBMP-4m)cDNA表达质粒的菌株,经50代传代,质粒不丢失,仍然稳定高表达hBMP-4m。将此菌株导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵、诱导表达,测定发酵菌液OD600值为43.5,离心收集菌体,PAGE电泳结果hBMP-4m占细菌总蛋白量的39％。悬浮所收集的菌体、裂菌,洗涤后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的85％。将少量包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解分别上SP阳离子和Q阴离子交换柱,用连续盐浓度的洗脱液洗脱蛋白,收集各蛋白峰做蛋白电泳分析,找到洗脱液的最合适盐浓度。然后将全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上阳离子交换柱SP柱,以最佳盐浓度洗脱液洗脱,获得纯度为91％的hBMP-4m。再上阴离子交换柱Q柱,最佳盐浓度洗脱液洗脱后,所得hBMP-4m纯度为98％。     

rhBMP-2m大规模制备纯化过程中使用尿素的分析

为大规模制备rhBMP-2m,将高表达rhBMP-2m的工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达,收集菌体,经裂菌和超声洗涤得到并纯化的包涵体。洗涤后的包涵体中,rhBMP-2mdi蛋白量的75．1％。为获得高纯度的rhBMP-2m,采用尿素作变性剂将包涵体溶解,经SP-SepharoseFF柱和Q-SepharoseFF柱两步纯化。rhBMP-2m包涵体经pH6．5尿素溶解后,经SP-Sepharose FF柱纯化,蛋白纯度为91％;若rhBMP-2m在碱性尿素中作用时间超过48h,再经Q-SepharoseFF柱纯化后,纯化产物中在还原性SDS-PAGE中会出现少量与rhBMP-2m二聚体大小接近的蛋白带,显示出碱性尿素对rhBMP-2m的共价修饰作用,会严重地影响rhBMP-2m的纯化效果和活性;若24h内完成分离纯化则影响较小,纯化后rhBMP-2m单体的纯度达98％以上。本研究表明尿素适合rhBMP-2m包涵体的大规模纯化。文章对使用尿素的利弊进行了讨论,提出大规模制备蛋白质时最好避免在碱性环境使用高浓度尿素。     

重组鲑鱼降钙素融合蛋白工程菌发酵工艺研究

为研究大肠杆菌表达重组鲑鱼降钙素融合蛋白(GST-sCT-Gly)工程菌的发酵工艺,采用瑞士比欧生物工程公司40 L发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行优化;在优化条件下,以40 L发酵罐发酵工程菌,菌体收获量可达到57 g/L,目的蛋白表达量占总蛋白的23.5%;结果表明,研究确定的发酵工艺可以提高工程菌收获量及目的蛋白的表达量,且稳定可靠,可应用于生产。     

HCV多表位抗原基因与β-半乳糖苷酶基因融合表达、产物纯化及酶活性分析

设计一个270bp的丙型肝炎病毒（HCV）复合多表位抗原基因（PCX）,与β－半乳糖苷酶（GZ）基因融合后,在高浓度肉汤培养基中,于转接1％量后3．25h,用终浓度为1mmol／LIPTG诱导4h发酵表达,其表达量最高,约占50％总蛋白量,表达产量GZ－PCX以包含体形式存在．利用改良的包含体纯化及溶解方法,可获得溶解率＞90％,纯度为96．2％的产物GZ－PCX,且包含体溶解产物较好保存其蛋白酶活．对PBS／EDTA透析,GZ－PCX蛋白的β－半乳糖苷酶活性可升高4倍,对H2O／EDTA透析其活性则明显下降．     

重组类人Ⅰ型胶原蛋白分离与纯化

目的 研究重组类人Ⅰ型胶原蛋白基因工程的下游工艺。方法工程菌株Escherichia coli BL213．1在Bioengineering L1 523型12．8L自控发酵罐中经24h发酵，细胞干重达到77．3g/L，表达量为菌体蛋白量的29．4％。发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后，依次经DEAE52，Sephadex G100柱层析分离纯化。结果最终产物纯度达到98％，回收率为80．5％。结论纯化的类人Ⅰ型胶原蛋白经SDS-PAGE电泳测定为电泳纯，分子质量为90ku，N端序列为NH2-H-D-P-V-V-L-Q-R-R-D-W-E-N-P-G，与基因序列设计一致。     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.     

TAT-NEP1-40融合蛋白的表达、纯化及蛋白转导功能的鉴定

为大量获得高纯度具有蛋白转导功能并可以穿过血脑屏障的融合蛋白TAT—NEP1-40,将构建好的表达载体pTAT—NEP1—40转化大肠杆菌BL21（DE3）进行表达后。将融合蛋白进行纯化和复性,鉴定蛋白转导功能。带有重组质粒pTAT—NEP40的大肠杆菌经IPTG诱导后,主要以包涵体形式表达,融合蛋白的分子量大小为14kD,其表达量占菌体总蛋白量的31．59％,纯化后目的蛋白纯度达95．6％,通过免疫组化染色显示融合蛋白可以穿过血脑屏障进入脑组织。上述结果表明利用pTAT—NEP1-40重组质粒,可以成功地表达TAT—NEP1—40;纯化后该蛋白具有穿过血脑屏障的功能,为NEP1-40功能的进一步研究提供了基础。     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

XynⅢ包涵体的纯化与变复性研究

常规诱导表达后收集的粗包涵体经3mol／L尿素洗涤加上表面活性剂Triton X-100作用，可将包涵体中xynⅢ的含量从37％提高到92．4％；8mol／L尿素可将包涵体完全溶解；蛋白浓度在0．2～0．25mg／mL时，pH4．550mmol／L NaOAc与pH7．520mmol／L Tris—HCl缓冲液复性效果相当；降低蛋白浓度，则是pH7．520mmol／L Tirs-HCl缓冲液复性效果相对较好；复性过程中加入DTT、EDTA、尿素、木糖等处理复性效果没有明显提高；pH7．520mmol／L Tris—HCl、0．01mg／mL蛋白浓度条件下，包涵体的复性效果最佳．     

细胞毒性T细胞抗原4胞外结构域的高效表达与纯化

目的:获得细胞毒性T淋巴细胞相关分子4胞外结构域(exCTLA4)在大肠杆菌中高效表达的条件,并纯化获得高纯度的重组蛋白.方法:构建原核表达质粒pET28a-exCTLA4并转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,通过改变诱导物IPTG浓度、细菌培养温度和时间,获得了exCTLA4的最佳表达条件.收集最佳诱导条件下表达exCTLA4的菌体,将菌体超声破碎后,离心分离exCTLA4包涵体,用低浓度尿素(2mol·L~(-1))洗去大部分背景蛋白后,再用高浓度尿素(8mol·L~(-1))溶解包涵体,进一步用镍离子亲和层析方法得到高纯度exCTLA4.结果:构建了表达载体pET28a-exCTLA4,获得了exCTLA4在Transetta(DE3)中的最佳诱导条件,即在1mmol·L~(-1) IPTG、25℃下,诱导6h能得到最佳表达,但重组蛋白以包涵体形式存在.通过纯化exCTLA4包涵体及进一步的镍离子亲和层析获得了高纯度的目的蛋白,Western blot鉴定为CTLA4.结论:获得了exCTLA4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件和纯化方法及步骤,为该蛋白的应用奠定了基础.     

发酵性丝孢酵母产油脂中纤维质糖化液脱毒工艺对比及优化研究

纤维质在进行稀酸水解糖化时,会产生一些对菌体发酵有抑制作用的物质。为了除去抑制物,提高纤维质糖化液的发酵产脂能力,对玉米秸秆稀酸水解液的脱毒产脂条件进行了优化,优化结果为：蒸煮20min,活性炭用量为1.0g/L,乙醛用量为 0.4g/L,黄孢原毛平革菌接种量(以孢子 计)为4×10⁸L^-1。此时,菌体生物量为21.2g/L,油脂含量为50.9%,油脂质量浓度为10.8g/L,糖油转化率为13.5%。     

Scale-up of rifamycin B fermentation with Amycolatoposis mediterranei

Study of the effect of dissolved oxygen and shear stress on rifamycin B fermentation with A. mediterranei XC 9-25 showed that rifamycin B fermentation with Amycolatoposis mediterranei XC 9-25 needs high dissolved oxygen and is not very sensitive to shearing stress. The scale-up ofrifamycin B fermentation withA, mediterranei XC 9-25 from a shaking flask to a 15 L fermentor was realized by controlling the dissolved oxygen to above 25% of saturation in the fermentation process, and the potency of rifamycin B fermentation in the 15 L fermentor reached 10 g/L after 6-day batch fermentation. By continuously feeding glucose and ammonia in the fermentation process, the potency of rifamycin B fermentaion in the 15 L fermentor reached 18.67 g/L, which was 86.65% higher than that of batch fermentation. Based on the scale-up principle of constantly aerated agitation power per unit volume, the scale-up of rifamycin B fed-batch fermentation with continuous feed from a 15 L fermentor to a 7 m^3 fermentor and further to a 60 m^3 fermentor was realized successfully. The potency of rifamycin B fermentation in the 7 m^3 fermentor and in the 60 m^3 fermentor reached 17.25 g/L and 19.11 g/L, respectively.     

重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA可溶性AiiA蛋白的发酵条件优化

通过对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA的摇瓶发酵培养条件进行优化,确定了AiiA蛋白可溶性表达的最佳发酵培养基为牛肉膏蛋白胨.目的蛋白可溶性表达的最佳诱导条件为:IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导初始OD600为0.5,诱导时间为20 h,温度20℃,pH为7.0,微量元素Na2HPO420 mmol/L,250 mL三角瓶的装液量为70 mL.优化前可溶性AiiA蛋白的相对含量为2.23 mg/mL,占总目的蛋白的31.4%,优化后达到4.54 mg/mL,占总目的蛋白的60.3%,大大提高了目的蛋白的可溶性表达.     

甘蔗糖蜜发酵生产L-乳酸工艺条件研究

以甘蔗糖蜜作为原料,利用经诱变筛选得到的鼠李糖乳杆菌SCT-10-10-60发酵生产L-乳酸.通过设置单因素实验,研究不同初始糖蜜浓度(50％、40％、30％、20％)、不同发酵温度(30℃、37℃、42℃、47℃)、不同pH调节剂碳酸钙加入量(4％、6％、8％、10％)和氮源替代(尿素替代酵母粉)对L-乳酸产量的影响...     

稠油降解菌的筛选及其生物表面活性剂的特性

添加稠油对土壤中土著微生物进行驯化, 分离出33株能以稠油为惟一碳源生长的细菌, 从中筛选出2株高效表面活性剂产生菌XJ1和SJ4, 9株高效稠油降解菌. XJ1和SJ4可将发酵液的表面张力由72.4 mN/m分别降到36.1 mN/m和36.2 mN/m;14 d摇瓶油降解率分别为35.89%和31.59%, 降解效率在各单菌中最高. 同时研究了发酵液中XJ1和SJ4的生长量与其生物表面活性剂产生情况之间的关系, 经红外光谱分析初步确定两种生物表面活性剂均为糖脂类化合物.     

果胶酶产生菌HDYM-02发酵条件的研究

由巴彦县亚麻有限公司沤麻池中分离选育得到一株果胶酶产生菌,命名为HDYM-02,通过对其进行生理生化、16srDNA序列分析及系统发育研究,初步鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌。对菌株HDYM-02进行发酵条件的单因子试验,结果表明,当发酵温度为33℃,发酵氮源选用尿素,发酵液初始pH值为7.0,NaCl浓度为0.5%～0.7%时,菌株HDYM-02分解果胶能力较强;对发酵产还原糖影响较大的三个因素,即发酵温度、尿素含量、发酵液初始pH值进行L9(33)的正交试验,结果表明发酵温度为35℃,尿素浓度为0.5%,发酵初始pH值为6.5时,菌株HDYM-02分解果胶能力较强。     

短小芽孢杆菌BA06产表面活性素培养基组分的优化

本研究发现短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BA06菌株具有发酵产生表面活性素的能力,并对发酵培养基的组分进行了优化.单因素试验发现,麦芽糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钠对其产量影响较大;对上述4个因素进行正交优化组合得到该菌产生表面活性素的最适培养基:麦芽糖2.97%、NaNO_30.30%、酵母粉0.81%、蛋白胨1.10%、MgSO_40.01%、CaCl_20.01%、KH_2PO_40.24%、Na_2HPO_4 4.47%,pH 7.0;在此条件下进行了0.5L的发酵实验,表面活性素粗品产量从原来的1.43g/L增加至6.48g/L,提高了3.53倍.结果表明短小芽孢杆菌BA06菌株具有进一步开发、生产表面活性素的潜力.