里氏木霉几丁质酶基因的克隆及其同源转化研究

丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)外切几丁质酶具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性.根据里氏木霉基因组数据库获得了一个编号为21725的外切几丁质酶nagl基因序列,根据检索结果,从里氏木霉QM9414基因组DNA中克隆获得1.9kb的基因片段.构建了以cbhl为启动子和终止子的重组质粒pCbhNag,与含有pyr4基因的质粒pSKpyr4共转化里氏木霉pyr4缺陷株RutC30△U3.共得到99个转化子,初筛得到5株乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活较高的转化子,其中N3菌株的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活可达26.65 U/mL,而出发菌株的胞外几丁质酶几乎无酶活.成功实现了里氏木霉几丁质酶的克隆及同源表达.     

白孢链霉菌(Streptomyces albosporeus)CT—86几丁质酶研究

应用磷酸膨胀几丁质双层平板,从土壤中篩选到48株分解几丁质的链霉菌。经紫外线诱变后,得到一株能强烈分解磷酸膨胀几丁质的突变株CT—86。在1～1.5％的磷酸膨胀几丁质、1％豆饼粉的营养盐培养基中,30℃培养8～10天,酶活达到0.4mg N—乙酰葡萄胺/h。在几丁质浓废为0.5～1％范围内,单位酶活随几丁质浓度的增加而提高。以葡萄糖和N—乙酰葡萄糖胺为碳源时,在上述培养条件下,无酶活捡出。磷酸膨胀几丁质为底物,酶作用的最适温度是48℃,最适pH为6.5;酶液在60℃保温2小时后,酶活力丧失70％左右。     

斜纹夜蛾几丁质酶家族基因鉴定与时空表达分析

昆虫GH18家族几丁质酶属于多基因家族,在昆虫的蜕皮与变态过程中发挥着至关重要的作用,它催化表皮几丁质的降解.斜纹夜蛾是一种重要的农业害虫,危害290多种植物,但对其几丁质酶未深入研究.该文通过斜纹夜蛾转录组学分析,发现了12种潜在的几丁质酶,分属于8类.对这些几丁质酶在斜纹夜蛾变态发育时在表皮、中肠以及脂肪体的时空表达分析结果表明,Sl Cht5,Sl Cht9和Sl Cht2的表达水平在幼虫转化为蛹时上调表达,说明这些几丁质酶可能参与了斜纹夜蛾变态时期的脱皮作用;而其他几丁质酶的表达具有组织特性,表明它们可能具有不同功能,如Sl Cht6仅在中肠和脂肪体中表达,Sl Cht11,Sl Cht12和Sl Cht16主要在中肠和表皮表达,Sl IDGF2仅在表皮有表达,Sl IDGF3和Sl Cht9在三大组织均有表达.本研究结果对斜纹夜蛾几丁质酶家族基因的鉴定和时空表达作了初步的分析,为研究它们在斜纹夜蛾发育中的功能与调控打下基础.     

东亚飞蝗不同龄期解毒酶和靶标酶活性研究

对东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis(Meyen))各龄期酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肤 S-转移酶活性进行了比较研究,同时对酯酶进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶检测.酯酶活性测定结果表明,不同龄期酯酶的比活力不同,五龄若虫最高,一龄若虫最低.酯酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现,各龄期酯酶同工酶酶谱主带比较一致,在谱带上存在有细微的差异;乙酰胆碱酯酶的比活力二龄若虫最高,四龄若虫最低;一龄若虫谷胱甘肽S-转移酶的比活力最高,三龄若虫最低.据此推测,东亚飞蝗不同龄期解毒酶和靶标酶的活性差异可能是由于各龄期生长发育代谢机能的不同所致.     

脱乙酰几丁质对烟草叶片一些生理生化特性的影响

以温室栽培生长７￣８周的烟草第４片真叶为材料，测定了脱乙酰几丁质对细胞膜透性的影响。结果发现，脱乙酰几丁质处理的烟草叶片的电解质、可溶性蛋白质的外渗量和胞外可溶性过氧化物酶的活性均比对照组大，并且随所用的脱乙酰几丁质浓度增加而增大。Ｍｇ＾２＋、Ｃａ＾２＋、Ａｌ＾３＋能抑制脱乙酰几丁质诱导的蛋白质外渗。脱乙酰几丁质（５００μｇｍｌ＾－１）处理的烟草叶片的几丁酶和β－１，３－葡聚糖酶的活力，在处理６ｈ     

意大利蜜蜂AmCht11基因的克隆鉴定和发育时期表达分析

【目的】克隆鉴定和定量PCR组织表达分析意大利蜜蜂(Apis mellifera)几丁质酶AmCht11基因。【方法】克隆测序鉴定AmCht11基因序列,通过多重序列比对分析该基因编码的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测AmCht11蛋白的二级结构、三级结构以及相互作用靶蛋白,构建系统进化树分析该蛋白在几丁质酶家族中的分类和进化关系;实时定量PCR分析AmCht11基因的组织表达特征。【结果】AmCht11基因cDNA序列全长1404bp,编码468个氨基酸;预测AmCht11蛋白质相对分子质量为53.5kDa,等电点为7.21。多重序列比对和系统进化分析表明,AmCht11蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅷ亚家族成员,该蛋白的氨基酸序列N-端含有跨膜域,具典型的几丁质酶催化结构域,无结合结构域,也不具信号肽。进一步实时定量PCR分析表明,AmCht11基因表达量在意大利蜜蜂幼虫发育第2至第5日龄无明显波动,至幼虫后期第6日龄表达量明显上调。【结论】推测AmCht11基因与意大利蜜蜂幼虫发育后期的蜕皮有关。
     

意大利蜜蜂AmCht11基因的克隆鉴定和发育时期表达分析

【目的】克隆鉴定和定量PCR分析不同发育时期意大利蜜蜂(Apis mellifera)几丁质酶AmCht11基因。【方法】克隆测序鉴定AmCht11基因序列,通过多重序列比对分析该基因编码的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测AmCht11蛋白的二级结构、三级结构以及相互作用靶蛋白,构建系统进化树分析该蛋白在几丁质酶家族中的分类和进化关系;实时定量PCR分析AmCht11基因的组织表达特征。【结果】AmCht11基因c DNA序列全长1 404 bp,编码468个氨基酸;预测AmCht11蛋白质相对分子质量为53.5 k Da,等电点为7.21。多重序列比对和系统进化分析表明,AmCht11蛋白为几丁质酶GH18家族Group-Ⅷ亚家族成员,该蛋白的氨基酸序列N-端含有跨膜域,具典型的几丁质酶催化结构域,无结合结构域,也不具信号肽。进一步实时定量PCR分析表明,AmCht11基因表达量在意大利蜜蜂幼虫发育第2至第5日龄无明显波动,至幼虫后期第6日龄表达量明显上调。【结论】推测AmCht11基因与意大利蜜蜂幼虫发育后期的蜕皮有关。     

Cyclobacterium qasimii脱乙酰酶的异源表达及酶学性质

氨基葡萄糖因具有丰富的生物活性而被广泛应用,但目前其工业化生产均需利用浓酸在高温条件下进行脱乙酰反应;因此,需要寻找一种环境友好的生物催化法来取代酸水解法脱乙酰基。筛选并得到了来源于卡西氏菌Cyclobacterium qasimii的脱乙酰酶(CqCBDA),并将其成功地在大肠杆菌表达系统中进行了异源表达,且其具有较高水平的可溶性蛋白表达量。纯化后重组的CqCBDA具有N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶活性,比酶活力为11.5U/mg,最适温度为40℃,最适pH值为7.6,在低于40℃的条件下展现出较高的热稳定性。CqCBDA在酶解法生产氨基葡萄糖过程中具有较大的应用潜力,研究结果可为酶法绿色制备氨基葡萄糖提供理论参考。     

布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因的原核表达与鉴定

对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶(pgm)蛋白进行了表达与纯化,为研究该基因的功能提供了物质基础。首先利用PCR方法从羊种布鲁氏菌基因组DNA中PCR法扩增pgm基因,并将该基因亚克隆至pET-28a(+)载体中,转化入大肠杆菌(DE3),诱导表达融合蛋白;表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:扩增了pgm的全基因,成功构建了布鲁氏菌pgm基因的原核表达载体pET-28a(+)-pgm,并且在大肠杆菌中进行了表达,经Western blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,且具有良好的免疫反应性。本研究为进一步研究布鲁氏菌pgm蛋白的生物学功能提供基础物质,也为进一步开发基因工程疫苗提供理论基础。     

亚洲玉米螟细胞色素P450还原酶基因的克隆与表达分析

细胞色素P450还原酶(Cytochrome P450reductase,CPR),是细胞色素P450酶的氧化还原伴侣,在细胞色素P450介导的内外源物质合成与代谢过程中起关键作用。研究了克隆亚洲玉米螟细胞色素P450还原酶基因Cytochrome P450reductase(OfCPR),并对其进行了序列分析及基因表达分析。OfCPR cDNA全长为2 323bp(GenBank登录号为:MG255127),编码区长度为2049bp,编码682个氨基酸,预测分子量76.9kDa,理论等电点5.57。同源模建结果显示,该酶主要由N-端锚定区、FMN-结合结构域、连接结构域和FAD/NADPH结合结构域四部分组成。系统发育分析结果显示,OfCPR与鳞翅目昆虫CPR首先聚为一支,再与双翅目、同翅目CPR依次相聚。RT-qPCR结果显示,OfCPR基因在亚洲玉米螟幼虫和成虫期均有表达,而在一龄和五龄幼虫期,成虫期表达量相对较高。OfCPR基因在五龄幼虫期每一天均有表达,其中第三天相对较高,且在五龄幼虫肠道表达量较高。     

改进RBB染色法初步筛选几丁质酶基因chiA的表达

对RBB(Remazol Brilliant Blue)底物染色方法进行产几丁质酶细菌的酶活性筛选,应用几丁质胶体平板诱导表达的筛选取得好的效果.粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA在E.coli中的异源表达过程:首先从质粒pMD-chiA(DH5a)中切出含粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA的片段,将其插入到表达载体pET-22b( )内,构建成几丁质酶表达质粒pET-chiA.然后,转化进入DH5a感受态细胞内,鉴定正确后将pET-chiA质粒转入BL21(DE3)pLySS中进行表达,并进行初步筛选.     

基于密码子优化策略的厚壳贻贝几丁质酶原核重组表达及功能

厚壳贻贝mytichitin-1是一种特殊的,可通过裂解方式产生抗菌肽的几丁质酶。对该酶的研究有助于了解贻贝的免疫防御以及几丁质酶的功能多样性机制。为深入研究厚壳贻贝mytichitin-1的结构与功能,采取原核重组表达方式,结合密码子优化策略,获得适于大肠杆菌表达体系的目标基因。通过表达以及表达产物的分离纯化,获得重组mytichitin-1蛋白。经过SDS-PAGE,western blot以及质谱验证,表明重组mytichitin-1序列无误,表达成功,在此基础上,对重组mytichitin-1开展了几丁质催化活性,几丁质结合活性和抑菌活性研究。研究结果表明重组mytichtin-1具有明显的几丁质催化活性和几丁质结合活性;同时重组mytichitin-1表现出对细菌和真菌的抑制活性,且对真菌的抑制活性相对较强。上述研究不仅成功表达出厚壳贻贝mytichitin-1,同时也为后续研究几丁质酶的功能多样性及其分子机制,以及基于厚壳贻贝几丁质酶的蛋白质工程和应用研究奠定了基础。     

大肠杆菌aroG基因在枯草杆菌中的分泌表达

为了对大肠杆菌中由ａｒｏＧ基因编码的３－脱氧－Ｄ－阿拉伯庚酮糖酸－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ合成酶）进行结构与功能的深入研究,尝试了ａｒｏＧ基因在枯草杆菌中的表达。表达载体以ｐＵＢ１１０为骨架,采用了枯草杆菌热激蛋白ｇｒｏＥＳＬ基因的启动子,碱性蛋白酶ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ基因的信号肽和Ｎ－乙酰胞壁酸－Ｌ－丙氨酸酰胺酶ｃｗｌＨＢ基因的转录终止子,将ａｒｏＧ基因在枯草杆菌ＷＢ６００宿主菌中进行了分泌表达     

水稻碱性几丁质酶基因表达载体pCAMBIA1301-RC24的构建

用限制性内切酶Kpn1从质粒pYA024中切出大小约2．75kb的片段,此片段包含Actin1启动子、NOS终止子、水稻几丁质酶基因．将其插入到表达载体pCAMBIA1301-imp的多克隆位点内,构建成了水稻碱性几丁质酶基因的表达载体．利用液氮冻融法将构建好的表达载体导入发根农杆菌LBA4404中,以用于生物工程下游技术研究．     

利用细菌血红蛋白提高大肠杆菌基因工程菌几丁质酶基因的表达

将透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb)插入几丁质酶基因表达质粒中,然后转入大肠杆菌(Escherichia coli)内,研究vgb基因的表达对几丁质酶基因表达和产物分泌的影响．结果表明,在不同的通氧条件下,vgb基因的表达产物均能不同程度地促进细胞的生长,而且发酵上清液的几丁质酶活性也有提高;若溶氧浓度越低,则效果越明显,可比对照提高达12．1％．同时,由于vgb在大肠秆菌的表达,还可进一步促进几丁质酶在大肠杆菌中的分泌。     

飞蝗脂肪酸去饱和酶家族基因表达及功能分析

脂类是昆虫表皮重要成分之一,在避免昆虫体内水分蒸发、防止外源物质渗入和信息素合成等方面具有重要作用.脂肪酸去饱和酶(desaturases,desat)是脂合成通路的关键酶之一.文章以重要农业害虫-飞蝗为研究对象,对脂肪酸去饱和酶家族基因desats的表达及功能进行了研究.对飞蝗转录组数据库进行搜索结合基因组数据,获得...     

大肠杆菌BL21(DE3)氨基葡萄糖代谢调控相关基因的敲除及glmS在其中的表达研究

氨基葡萄糖(Glucosamine,GleN)是一类广泛使用的保健品,对于人类软骨再生及关节炎的临床治疗都具有良好的疗效.为构建以代谢工程为基础的氨基葡萄糖生产菌株,采用λRed同源重组系统将大肠杆菌BL21(DE3)中甘露糖-磷酸转移酶系统操纵子(manXYZ)和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)转运和代谢特异性系统操纵子(nagBACD-nagE)进行双剔除.随后构建含新型氨基葡萄糖合成酶基因(glmS)的表达载体pETG,并将它转化该双操纵子剔除菌株.结果表明,改造后的菌株不能以GleN或GlcNAc作为碳源进行代谢生长.表达GlmS菌株的上清液经Ni-NTA亲和层析纯化,其酶活性达8.63 U/mg,表明该菌株已具备发酵生产GleN的初步特性.     

几丁质脱乙酰基酶基因serpentine和vermiform对果蝇发育的影响

几丁质脱乙酰基酶(CDAs)基因是昆虫体壁等部位几丁质的修饰酶,在昆虫的生长发育中具有重要作用。文章旨在初步探索果蝇CDAs基因(serp和verm)对果蝇发育的影响。采用模式生物果蝇Gal4/UAS系统驱动serp和verm基因在果蝇全身、表皮、气管、咽侧体、神经和眼中的表达下调,观察其后代的表型。研究结果发现降低果蝇全身、表皮和气管中的serp和verm基因的表达,均会导致果蝇死亡;而减少其在几丁质含量低的咽侧体、神经和眼中的表达,并不会影响果蝇的生长发育。说明serp和verm基因主要在果蝇富含几丁质的部位起重要作用。     

微生物几丁质酶的特性及其应用的研究进展

几丁质酶可以降解几丁质,其降解产物可以用于抗虫、医药、化工、食品等领域.目前已从微生物中获得多种几丁质酶并克隆其几丁质酶基因.本文主要对产几丁质酶微生物的分类及其分布特点、微生物几丁质酶的性质、结构、基因调节及应用等进行综述.