类人胶原蛋白生物相容性实验研究

目的 为扩大类人胶原蛋白的应用，评定和比较猪胶原蛋白、类人胶原蛋白和明胶在动物体内的生物相容性。方法分别用胶原材料和明胶进行以下生物学测试：急性毒性试验、溶血试验、热原试验、皮肤刺激试验。根据标准对试验数据进行分析和评估。结果类人胶原蛋白的急性毒性试验、溶血试验、热原试验、皮肤刺激试验均为阴性。结论材料生物学测试结果显示类人胶原蛋白较其他两种材料的生物相容性更高，是理想的医用生物材料。     

类人胶原蛋白-微孔淀粉的制备及生物学评价

文中以微孔淀粉为主体,研究一种新型复合止血材料的制备及生物学评价。此复合材料由一定比例的α-淀粉酶与糖化酶复合后处理淀粉以形成微孔结构,然后复合类人胶原蛋白,再以戊二醛为交联剂进行交联;用SD大鼠作肝脏出血模型进行止血效果对比试验。通过正交试验确定微孔淀粉最优制备工艺条件如下:α-淀粉酶:糖化酶=1∶3,T/℃=50,t/h=20,pH=4.8;用0.2%(V/V)戊二醛乙醇溶液交联的类人胶原蛋白-微孔淀粉止血材料,在相同的止血时间下,该复合材料平均吸水率为3 580%,对照组(分别是微孔淀粉和类人胶原蛋白海绵)的平均吸水率为3 160%和3 280%。而在SD大鼠肝脏实验中,复合材料t/s=94±13,而外购的止血剂t/s=121±15。类人胶原蛋白-微孔淀粉复合材料止血的止血原理从3个方面展开:①微孔淀粉吸收水分并将血液中的有形物质聚集到表面;②加速内源性凝血因子的激活使其形成血栓;③在类人胶原蛋白的牵引下,淀粉颗粒聚成团大幅度增加了比表面积,使止血效果更优秀;对照组止血机理只包含了该复合材料的前两个方面。结果显示,复合材料的止血效果要优于普通微孔淀粉制成的止血剂,证明该复合止血材料具有良好的止血性能。     

重组类人胶原蛋白Ⅰ的层析分离

目的研究重组类人胶原蛋白的基因工程下游工艺对阴离子交换树脂（DE52）和阳离子交换树脂（CM52）的吸附效果。方法将基因工程菌E．coil BL 21经超声破碎、硫酸铵盐析、超滤浓缩后，再进行批量层析进一步分离纯化。结果得到最佳实验条件：采用阴离子交换树脂，pH值为6．0。盐浓度为0．2mol／L，蛋白进样浓度为0．4％（质量分数）。结论在HCBI的纯化过程中，阴离子交换树脂（DE52）较阳离子交换树脂（CM52）的分离效果更优，最终产物的纯度达到95．98％，回收率为91．7％，纯化倍数为5．3。纯化的类人胶原蛋白Ⅰ经SDS—PAGE电泳测定为电泳纯，分子质量为90ku。     

重组类人胶原蛋白Ⅱ膜的生物相容性

目的探讨用戊二醛交联得到的重组类人胶原蛋白Ⅱ(recombinant human-like collagenⅡ,RHLCⅡ)膜的生物相容性。方法用浓度为0.005 mol/L和0.01 mol/L的戊二醛分别交联RHLCⅡ得到两组RHLCⅡ膜(0.005 mol/L组和0.01 mol/L组);把成纤维细胞接种到两组RHLCⅡ膜上,用倒置显微镜和扫描电子显微镜观察细胞贴附情况;用MTT法分析成纤维细胞在两组RHLCⅡ膜上的生长和增殖情况;通过细胞毒性实验评价两组RHLCⅡ膜的细胞毒性。结果当成纤维细胞培养到6 h时,均能贴附于两组RHLCⅡ膜上;培养到96 h时,两组RHLCⅡ膜上的成纤维细胞均融合成片并形成多层细胞;经MTT法分析,细胞接种后96 h,成纤维细胞在两组RHLCⅡ膜上均能实现增殖;0.01 mol/L组比0.005 mol/L组细胞毒性要大,但两组在各时间段,毒性评定均在0~1级,细胞毒性实验合格。结论戊二醛浓度为0.005 mol/L和0.01 mol/L的RHLCⅡ膜具有良好的生物相容性。     

仿生人工骨修复材料研究

骨缺损修复材料是临床需求量最大的生物医用材料之一.自体骨和异体骨移植的局限性使得研发优异的人工骨修复材料意义重大.通过模仿天然骨本身的成分、结构特性及生物矿化过程,对材料的组成、结构进行设计与调控,可以获得新型仿生人工骨修复材料,这已成为生物材料发展的主要趋势之一.文中概述了仿生人工骨修复材料的研究进展,重点介绍本课题组的相关研究,即类骨微纳米磷酸钙矿物的仿生合成、生物医用高分子仿生纳米纤维支架的制备和具有多级孔结构的自固化磷酸钙基骨修复材料的构建.     

类人胶原蛋白-钙螯合物的制备及相关研究

为了制备安全性高且补钙性能优良的补钙制剂,以水体系合成法制备类人胶原蛋白（human-like collagen, HLC）-钙螯合物,探究体系pH值和原料配位比对钙螯合率的影响,并采用紫外-可见吸收光谱和傅立叶红外光谱对制备的类人胶原蛋白-钙螯合物进行分析.确定的最佳工艺条件为：体系pH值5．0,且HLC与CaCl2的质量比10∶1.光谱结果显示：类人胶原蛋白分子和Ca2＋之间存在相互作用,且制备的钙螯合物是一种异于HLC的新化合物;羰基和亚氨基参与HLC分子与Ca2＋间的螯合反应,且钙螯合物保持类人胶原蛋白分子原有的α-螺旋结构.研究结果为类人胶原蛋白-钙螯合物的大规模制备和进一步应用开发提供了理论依据和研究基础.     

重组类人Ⅰ型胶原蛋白分离与纯化

目的 研究重组类人Ⅰ型胶原蛋白基因工程的下游工艺。方法工程菌株Escherichia coli BL213．1在Bioengineering L1 523型12．8L自控发酵罐中经24h发酵，细胞干重达到77．3g/L，表达量为菌体蛋白量的29．4％。发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后，依次经DEAE52，Sephadex G100柱层析分离纯化。结果最终产物纯度达到98％，回收率为80．5％。结论纯化的类人Ⅰ型胶原蛋白经SDS-PAGE电泳测定为电泳纯，分子质量为90ku，N端序列为NH2-H-D-P-V-V-L-Q-R-R-D-W-E-N-P-G，与基因序列设计一致。     

类人胶原蛋白基因工程菌高密度发酵过程控制

目的优化基因工程菌Escherichia coli BL 21生产人源型胶原蛋白的高密度发酵工艺。方法建立一套以溶解氧浓度和比生长速率为中心的控制策略,采用溶氧反馈或pH反馈调节补料速度。结果 OD600可达150,胶原蛋白的表达量为9g／L。结论 20％-30％饱和度的溶解氧和0．1- 0．2 h-1的比生长速率有利于细胞生长和产物表达,其与降低乙酸等有害代谢副产物的积累密切相关。     

类人胶原蛋白对BHK-21细胞生长的影响

目的研究类人胶原蛋白HLC（Human—like Collagen）对于细胞生长、细胞凋亡、细胞生长周期及细胞形态的影响。方法用体外细胞培养法，选用BHK-21细胞系为实验对象，进行MTT检测、LDH测定、流式细胞分析、形态学观察及统计学分析。结果MTT检测表明0．2，0．3g／LHLC对于细胞生长有显著的促进作用；HLC对于细胞培养液中LDH浓度无显著性影响；经0．1，0．2，0．3g／LHLC作用后的细胞凋亡百分数变化不大，进一步作周期分析，也无显著影响；形态学观察表明0．3g／LHLC对于细胞形态有加长作用。结论HLC可能通过影响细胞膜、增强细胞贴壁生长而促进细胞生长。     

重组大肠杆菌分批-补料培养生产类人胶原蛋白的过程控制

目的优化重组大肠杆菌高密度发酵的调控工艺。方法通过考察比生长速率、3种控氧方式以及诱导强度对细胞和类人胶原蛋白产量的影响,确定最佳的发酵工艺。结果比生长速率显著影响类人胶原蛋白的产量,且最适比生长速率为0.15～0.20h-1;在提高罐压的条件下,细胞和类人胶原蛋白的浓度均显著高于其他两种控氧方式,充入富氧空气的细胞和类人胶原蛋白的浓度均最低;诱导强度对细胞生长和蛋白质表达的影响非常大,当细胞浓度达47±2g/L(DCW)时,开始升温至42℃进行诱导,最佳条件为42℃保温2～3h,然后降温至39℃继续培养5～6h。结论通过优化重组大肠杆菌分批补料培养生产类人胶原蛋白的工艺,使得细胞和类人胶原蛋白浓度分别达68.94g/L(DCW)和13.02g/L。     

固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白

目的 研究利用固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白的洗脱方法 ,以优化分离纯化的条件.方法 将吸附了重组类人胶原蛋白的层析柱采用降低pH,增大离子强度和增大NH4Cl浓度3种方法 进行洗脱.结果 采用增大NH4Cl浓度的方法 进行洗脱所得的洗脱峰面积最大,洗脱体积最小,纯化后重组类人胶原蛋白的纯度达97.9%,回收率为68.6%,纯化倍数为2.78.结论 采用固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白是可行的,可有效地对重组类人胶原蛋白进行纯化.     

类人胶原蛋白工程菌质粒稳定性研究

目的研究基因重组大肠杆菌补料分批发酵生产类人胶原蛋白过程中质粒稳定性。方法通过平板复制法,观察质粒稳定性在不同生长周期、卡那霉素浓度和不同比生长速率中的变化。结果质粒稳定性受生长周期、卡那霉素和比生长速率的影响。在μ为0.15、卡那霉素浓度为0.005g/L的情况下,工程菌生产效率最理想。结论通过控制发酵过程中的质粒稳定性可以有效地提高菌体产量和目标蛋白产量。     

类人胶原蛋白基因工程菌诱导后比生长速率优化

目的优化类人胶原蛋白基因工程菌高温诱导后的比生长速率。方法通过分析不同比生长速率下发酵液中菌体浓度、类人胶原蛋白浓度、细胞得率系数(YX/S)、产物得率系数(YP/S)的变化,确定诱导后的最佳比生长速率。结果当比生长速率为0.04～0.05h-1,细胞浓度和类人胶原蛋白的浓度分别可达69.5g/L(DCW)和13.8g/L。结论诱导后的比生长速率对细胞生长、类人胶原蛋白的合成均产生显著性影响。     

类人胶原蛋白表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

基于人胶原蛋白胶原域序列特征,设计合成了一段类人胶原蛋白基因单体gel.采用同向串联方式,构建了含6个单体的类人胶原蛋白表达载体pPIC9KG6,并经DNA测序鉴定.将pPIC9KG6电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)经G418筛选得到多拷贝转化子,通过甲醇诱导表达类人胶原蛋白,SDS-PAGE检测表明:初步表达的类人胶原蛋白为胞外产物,其表观分子量为112 ku.     

响应面法优化一种新型类人胶原蛋白发酵培养基

目的 借助于MINITAB统计学软件,采用Plackett-Burman设计和响应面优化法对基因工程菌Escherichia coli BL21发酵生产类人胶原蛋白的原始培养基进行优化研究.方法 首先利用 Plackett-Burman设计筛选出对类人胶原蛋白产量影响显著的3个因素,即葡萄糖甘油1:4混合碳源、酵母粉和硫酸铵.在此基础上用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,找到后续实验的中心点.再利用Box-Behnken实验设计及响应面分析法进行回归分析,确定主要影响因素的最佳水平.结果 优化后的3种主要影响成分为葡萄糖甘油1:4,混合碳源12.24 g/L,硫酸铵7.12 g/L,酵母粉5.53g/L.结论 方程拟合良好,优化后的培养基发酵产量经摇瓶和发酵罐验证,产量分别为5.91g/L和6.12g/L,较优化前分别提高了306%和296%.     

骨再生修复材料的仿生制备及生物分子调控矿化

采用冷冻干燥和纳米合成技术,仿生制备出BG-COL-HYA-PS骨修复材料,并利用体外仿生矿化实验、生物组装技术、动物体内植入实验和组织形态学观察以及扫描电镜(SEM)、能谱微区分析(EDS)、X射线衍射(XRD)等技术,对材料分别在模拟体液、培养液中以及体内的生物矿化及其调控机制进行了研究.实验表明,胶原蛋白、透明质酸、磷酸丝氨酸等生物分子作为天然细胞外基质,在调控矿化方面起到了重要作用;所制备的材料可促进骨再生修复.     

骨关节仿生滑液的制备设计与应用最新进展

骨关节仿生滑液是一种极具应用前景的润滑剂,为骨关节疾病的缓解治疗和工业润滑提供了新的思路.本研究详细介绍了骨关节仿生滑液的常见主要性能,如水合特性、黏度性质、非牛顿流体特性、高保湿性、生物相容性、自润滑性等.通过对关节滑液进行分子结构模拟、化学成分模拟和功能模拟来指导骨关节仿生滑液的设计制备,优化其适应性,在机体关节内充分发挥减摩润滑和防止关节软骨进一步磨损等效用,有望实现对关节炎的缓解治疗和拓宽先进工业润滑应用.基于骨关节仿生滑液的设计制备和应用目前仍停留在实验室阶段,还需进一步深入研究,以期其优异性质在人工关节和先进工业润滑领域得到良好的应用.     

仿生矿物材料的研究现状

近年来,随着仿生矿化的研究不断深入,研究思路和方法都有了较大的进步,文章主要介绍了生物矿物的种类、生物矿化的过程和简单机理以及生物矿物材料的研究现状。     

纳米仿生骨组织材料的生理响应及生物矿化

利用溶胶－凝胶法合成了两种具有纳米结构的新型高生物活性骨修复及骨组织工程支架材料，并利用体外实验方法（In Vitro)以及X－射线衍射（XRD），扫描电子显微镜（SEM），红外光谱（FTIR），氮气吸附－解吸（BET）和等离子发射光谱（ICP）等技术对材料的显微结构及其在模拟生理溶液（SBF）中的降解过程，表面反应产物及生物矿化机理进行了研究，研究表明：两种溶胶－凝胶材料均具有较高的生物活性；由于化学组成不同，它们在SBF溶液中的离子扩散规律及生物矿化行为有所不同。     

重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白Ⅱ的发酵pH优化

为了实现类人胶原蛋白(HLCⅡ)的规模化生产,对重组大肠杆菌BL21 3.7在30 L发酵罐中发酵生产类人胶原蛋白Ⅱ过程中的关键参数pH进行了系统的研究.将发酵过程中pH控制在6.0~7.8之间,监测pH对细胞生长以及类人胶原蛋白Ⅱ的产量的影响,从而确定出合理的pH控制策略增加类人胶原蛋白Ⅱ的产量.由实验数据可得,在pH7.5条件下细胞浓度达到最大,为68.5 g/L,但HCLⅡ的浓度为8.5 g/L.在pH6.8条件下,HLCⅡ浓度达到最大,为10.5 g/L,但其细胞浓度只有60.9 g/L.同时,对发酵过程中代谢副产物有机酸的含量也进行了监测,随着发酵过程pH值的升高,总有机酸的量也相应的增加,当发酵过程pH控制在7.8时,总有机酸达到最大,为15.61 g/L.为了提高目标产物的产量,采用pH两阶段控制策略控制发酵,最终类人胶原蛋白Ⅱ浓度可达到11.3 g/L,较恒pH条件下提高了7.61%.