人和鼠脑cDNA文库的建立以及全长cDNA的批量分离

应用λZAP Express cDNA文库构建试剂盒构建了人3个月和8个月胎儿脑及大小鼠脑cD-NA文库.第2链cDNA经Sepharose CL-4B凝胶过滤层析后去除了较小的片段,使大片段cDNA具有较高的克隆效率.所建立的文库具有较长的插入片段.合并不同长度范围的人3个月胎儿脑cDNA片段,分别克隆入文库载体,获得了长片段、中片段、短片段及合并cDNA文库.从分级文库中各随机挑取300个克隆,经载体引物PCR扩增后,测定5'末端序列,一共获得894个表达序列标签(EST)序列.根据同源性比较结果将感兴趣的克隆环化后测定全长cDNA序列,得到了12条新的全长cDNA.这些文库的建立以及新EST,cDNA的分离为文库筛选和获得脑表达的新基因奠定了基础.     

用差减cDNA文库筛选由热激导致的小鼠睾丸中差异表达的基因

采用抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）方法,构建正常和热激小鼠睾丸组织的差减 cDNA 文库,以期 筛选出小鼠生精过程中对热敏感的基因。分别从正常和热激小鼠睾丸组织提取总RNA,反转录成cDNA,以正常小鼠睾丸组织cDNA作为待检组织(tester),以热激小鼠睾丸组织cDNA作为驱动组织(driver), 经过2轮杂交和抑制性PCR扩增,产物与T载体连接,经蓝白斑筛选,提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了2种组织间差异表达基因的差减cDNA文库。用半定量RT-PCR方法,进一步验证 了该文库中差减出的基因基本上为差异表达的基因。对随机挑选其中的932个克隆测序,对有效测序的565个基因序列与GenBank数据库中发布的序列进行同源性比较,大部分片段都可以检索到同源序列。 结果显示,cPGES/p23等13个基因热激后表达量上调;septin2等120个基因热激后表达量下调。其中cPGES/p23为本研究中首次发现的小鼠生精过程中对热敏感的基因。     

干旱胁迫下开花期玉米消减文库的构建及分析

分别以1d干旱和7d干旱处理的开花期玉米顶叶cDNA为tester，正常生长的玉米顸叶cDNA为driver，利用抑制性差减杂交技术构建了两个干旱胁迫下开花期玉米消减文库．两个文库的重组率均高于95％，插入片段集中在300—600bp之间．对两个文库部分克隆进行测序发现，文库中含有脱水素、蔗糖合成酶、甜菜碱醛脱氢酶。DRE结合因子等大量的抗旱相关基因，说明两个干旱胁迫下开花期玉米抑制性消减文库已经构建成功。且具有重要意义．     

淞江鲈肝脏组织cDNA文库的构建与部分EST测序

以成年雌性淞江鲈肝脏组织为材料,用TRIzol Reagent试剂提取总RNA.以总RNA为模板,先用逆转录酶合成cDNA第一链,再通过LD-PCR合成cDNA第二链,所得双链DNA分子用SfiⅠ酶切处理后,连接到同样经SfiⅠ酶切处理的改良pUC19载体上,获得重组质粒.将重组质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,建成质粒cDNA文库.经鉴定,该文库库容为1.5×106,重组率为94.5%,平均插入片段长度为1.1kb,插入片段大小分布为0.5~2.0kb.从文库中随机挑选2 200个克隆进行5’端单向测序,剔除不合格序列后,得2 002条高质量表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)序列,提交dbEST数据库.经筛选,从这些EST序列中共发现471个基因,分别对其进行了KOG功能分类预测(216个蛋白被注释上21种KOG分类)、KEGG注释(186个基因注释上175个KO,139个基因注释上195个pathway)和GO功能分类注释(312个蛋白被注释上GO分类).     

应用抑制性消减杂交技术构建人肝癌组织特异表达cDNA文库

为克隆和筛选肝癌特异表达基因.应用抑制消减杂交技术对肝癌及癌旁组织进行消减杂交,产物PCR扩增后,进行克隆.共得到1820个克隆,1776个克隆有100~800bp的插入片断,阳性率达98%,说明人肝癌组织特异表达cDNA消减文库构建成功,同时我们对cDNA克隆进行测序,证明这些克隆的功能是和肝癌的发生高度相关的.抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法.     

通过差减文库筛选山羊羔肠道淋巴集结特异表达基因

羊羔肠道淋巴集合淋巴结（Peyer's patch，以下简称PP），是B淋巴细胞的主要来源地和发育、成熟场所，兼具中枢淋巴器官和周围淋巴器官的功能.采用抑制性差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）方法，构建山羊羔肠道淋巴集结与其非PP肠壁组织的差减 cDNA 文库，以期找到在山羊羔肠道淋巴集结中特异表达的与免疫相关的基因. 分别从山羊羔PP与非PP肠壁组织提取总RNA，反转录成cDNA，以PP作为待检组织(tester)，非PP肠壁作为驱动组织(driver)，经过两轮杂交和抑制性PCR扩增，产物与T载体连接，经蓝白斑筛选，提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了两种组织间差异表达基因的差减cDNA文库. 对其中160个克隆测序，得到几个可能与免疫相关的基因，为进一步从中挑选和表达活性蛋白基因用于生产免疫增强剂奠定了基础.     

PiggyBac 转座子在肝脏中的活性研究

本实验运用高压尾静脉注射的方法将PB转座系统导入小鼠肝脏,研究其在肝脏中的转座活性,系统中PB转座子携带表达红色荧光蛋白的基因以指示转座的发生.注射10个月后取出小鼠肝脏,体视荧光显微镜观察肝脏是否有红色荧光,并通过基因组PCR、splinkerette PCR分析PB转座子在肝脏中的插入情况.实验结果表明,PB转座子在肝脏内发生高效转座,检测的68个PB插入位点中有34个位于基因序列,使得PB系统可以作为有效的基因诱变工具来研究基因功能.     

人基质细胞中新基因的获得及目的基因的克隆

取连续培养的骨髓基质细胞并提取其mRNA,合成cDNA后,收集＞400bp的片段,连接到真核表达载体pcDNA3.0上,构建人胎儿骨髓基质细胞真核cDNA质粒文库,并以PCR的方法从文库中扩增出编码人IL－6、SCF的基因序列,随机对文库克隆进行测序,得到了3个新基因EST,其中2个在GenBank的登录号分别为AF244998及AF244999。     

石斑鱼卵巢cDNA文库构建及脂肪酸结合蛋白克隆

应用SMARPTM技术构建了斜带石斑鱼Epinephelus coioides卵巢cDNA文库。所构建的cDNA文库滴度为4.5×106 pfu/mL,重组率为99％,扩增后文库的滴度为1.2×1010pfu/mL。把phagemid转化为质粒后,随机挑选60个阳性克隆进行酶切鉴定和测序。酶切结果表明:插入片段长度均在500~3 000 bp之间。测序结果经过生物信息学分析,发现其中一个克隆为脂肪酸结合蛋白(FABP)基因全长,并与人肝型(L)脂肪酸结合蛋白同源性最高,为70％。     

忽地笑(Lycoris aurea)叶片cDNA文库的构建与分析

用表达型噬菌体载体ZAP构建了忽地笑叶片cDNA文库。文库宿主菌为E.coliXL1 BLUE,亚克隆空菌为E.coliXLOLR。初始文库的滴度为5.6×105pfu/mL,扩增文库的滴度为6.9×109pfu/mL,含插入片段的频率为96%,插入片段大小在0.5～2.5kb,文库质量良好。为进一步从基因组学和分子生物学方面研究忽地笑叶片发育及克隆相关全长基因奠定了基础。     

4种兜兰RubisCO的分离纯化及酶学性质初步研究

采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析与凝胶过滤层析的方法，分离纯化得到硬叶（P. micranthum）、紫纹（P. purpurattum）、带叶（P. hirsutissimum）和亨利（P. henryanum）4种兜兰RuBisCO的大、小亚基，分子量分别为51.5~54.5kD和15~16kD. 4种兜兰RubisCO的羧化/加氧活性在pH8.0、温度30℃时最高，其活性大小顺序为硬叶兜兰紫纹兜兰亨利兜兰带叶兜兰，且紫纹兜兰、亨利兜兰的羧化/加氧活性比值相对高于硬叶兜兰、带叶兜兰；硬叶兜兰RubisCO的Km（RuBP）值最小.4种兜兰RubisCO的特性反映了其不同的生理和生境特征.     

南京地区美洲黑杨雌、雄花芽分化的解剖学研究

【目的】研究多年生木本植物花芽分化进程和特点,揭示树木成花分子调控机制。【方法】分别以南京地区成年美洲黑杨(Populus deltoides)雌株和雄株为材料,详细记录其花芽发育的完整过程,并采用石蜡切片技术对雌、雄花芽发育各阶段进行解剖观察。【结果】在南京地区,每年5月底至6月初成年美洲黑杨的当年花枝上形成肉眼可见的花芽。随后的花芽分化过程可以分为5个阶段:苞片分化期(6月中旬之前)、小花原基起始期(6月中旬至7月中旬)、雌蕊/雄蕊分化期(7月中旬至11月)、休眠期(12月至翌年1月)和雌/雄配子体形成期(翌年2—3月),最终在早春形成单性花。【结论】美洲黑杨雌、雄花均为Ⅱ型单性花,即某一性别花中不存在相反性别花器官的残留。在整个花芽发育过程中,雄花芽较雌花芽大而饱满,雌、雄花芽鳞片外观嫩绿、质地坚硬,花芽长度生长趋势呈“S”形曲线。研究结果可为进一步深入研究杨树花器官发育及性别分化的分子机制提供必要的前提和基础。     

西藏胡黄连根状茎差异表达基因的筛选及分析

 西藏胡黄连是著名的濒危西藏药材, 其粗壮的根茎部是重要的合成和储存药用萜类物质器官,萜类含量显著高于叶部。为克隆西藏胡黄连根状茎和叶的差异表达基因,利用抑制消减杂交技术,构建了根状茎特定的抑制消减文库。从该SSH文库中随机挑取片段不一的阳性克隆测序,采用Blastx进行同源比对,获得了27个表达序列标签（EST）,并获登录号。序列统计分析结果表明,其中有11个EST在GenBank中无同源性序列,推测可能是新基因片断。蛋白质功能分类结果表明,这些蛋白质与翻译、能量代谢、转运与结合、细胞膜合成、氨基酸生物合成及中间代谢6大类蛋白功能有关。为深入研究与萜类生物合成直接或间接相关基因,选择了长595 bp的差异表达EST序列EX172715进行了同源比对和蛋白系统进化分析。结果表明,EX172715具有细胞色素P450单加氧酶的特征结构,与拟南芥的细胞色素P450单加氧酶蛋白的同源性高于水稻和小麦。提供了一组与西藏胡黄连次生代谢相关的新基因库。     

Gene expression profiling related to powdery mildew resistance in wheat with the method of suppression subtractive hybridization

“Bainong 3217 × Mardler” BC₅F₄ wheat line at the initial stage of inoculation with powdery mildew pathogen (Erysiphe graminis DC) was used to construct a suppression subtractive hybridization (SSH) cDNA library. Totally 760 ESTs were obtained through sequencing. Similarity analysis of ESTs based on BLASTn and BLASTx with the sequences in GenBank, in combination with macroarray differential screening, revealed that 199 ESTs of 65 kinds were known to be functionally disease resistance related. Based on the gene expression profiling in the present study, it is postulated that salicylic acid (SA) and MAP-related signal transduction pathways were involved in powdery mildew resistance in wheat. System acquired resistance genes were predominant in terms of kinds and quantity. With the initiation of cell defense reaction, the genes conferring anti-oxidation substances were largely expressed and thus cell protection mechanism was activated. Much evidence revealed that phenylpropanes metabolic pathway was involved in phytoalexin synthesis in wheat powdery mildew resistance. Genes conferring some enzymes of structural modification of cell walls and proteinase inhibitors inhibiting pathogen growth were also detected. The genes controlling a few proteinases (mainly cysteine proteinase) had a considerable redundancy of expression.     

Discovery of immune related factors in Fenneropenaeus chinensis by annotation of ESTs

A total of 10446 expressed sequence tags (ESTs) are obtained by a large-scale sequencing of a cDNA library from cephalothorax of adult Fenneropenaeus chinensis.An EST analysis platform was built up based on local computers and bioinformatic techniques were used to annotate these ESTs in order to promptly find possible functional genes, especially for immune related factors.About 4% of the ESTs show similarity to the coding sequences of such factors, including lectin, serine protease, serpin, lysozyme, etc.These ESTs provide a partial profile of the immune system in F.chinensis and useful information for further study on these genes.     

兔肌肉生长抑制素基因的cDNA克隆及初步分析

以兔骨胳肌为实验材料,构建了兔骨骼肌cDNA文库,根据该基因保守序列,设计简并引物,利用RT-PCR技术,克隆了兔MSTN基因EST片段,以EST片段为探针,应用Southern杂交技术筛选文库,克隆了兔肌肉生长抑制素基因全长cDNA并在GenBank注册(注册号:AY169410).用生物信息学方法对该基因进行了比较分析,表明从氨基酸序列及进化角度兔和其他哺乳类生物的肌肉生长抑制素基因之间关系密切.     

南京地区簸箕柳雌、雄花序建成动态观察

【目的】 柳树雌株性成熟后会产生严重的飞絮污染,阐明其性别分化的分子机制是控制飞絮污染的关键。研究柳树雌、雄花芽分化以及花序建成的关键时期,为性别分化分子调控机理研究奠定基础。【方法】 以木本植物簸箕柳(Salix suchowensis)雌株和雄株花芽及花序为材料,从当年6月至翌年2月分别在17个时间点采集样品,利用石蜡切片技术对其雌、雄花芽分化及花序建成过程进行观察,分析不同发育阶段的相关特征。【结果】 簸箕柳花序建成初期为6月中旬至7月初,小花原基分化期在7月中旬至8月下旬,雌、雄蕊分化期在9月上旬至11月初,11月中旬至翌年2月初雌雄花序进入休眠期,翌年2月中旬至3月为大小孢子发生及雌雄配子体发育期,随后雌雄花序开放。研究表明,花序外观形态变化与内部解剖结构变化之间具有一定的相关性。【结论】 簸箕柳雌、雄花均为单性花。花序生长趋势总体呈“S”形上升趋势,在整个发育过程中,雄花序比雌花序外形稍大。簸箕柳花序外观形态可以用于判断花发育的关键时期。研究结果为全面了解簸箕柳花芽分化以及花序建成的完整过程提供了详细信息,为进一步阐明不同关键发育阶段的分子调控机制奠定了基础。     

Expressed sequence tags analysis revealing the taxonomic position and fatty acid biosynthesis in an oleaginous green microalga, Myrmecia incisa Reisigl (Trebouxiophyceae, Chlorophyta)

cDNA library of Myrmecia incisa H4301 was constructed using λ phage vectors.The library consisted of 1.5×10 6 clones with a recombination rate of 90%,and 1942 clones were randomly sequenced.All 1854 readable expressed sequence tags(ESTs) were clustered into 596 non-redundant sequences(NRSs),among which 126 NRSs were from 1384 ESTs,showing a high redundancy.Among the 596 NRSs,30 were ribosomal RNA,and 152 significantly matched with those available in NCBI database and JGI Genome Portal,the latter were divided into nine subcategories.Overall,59 NRSs were involved in photosynthesis,the respiratory electron transport chain,ATP synthesis,oxidation reduction,fatty acid biosynthesis,glucose metabolism,protein metabolism,and small molecular metabolism,suggesting that these genes were abundantly transcribed during energy and substance metabolism.Acyl-carrier protein,ferrodoxin and fatty acid elongase genes obtained from this cDNA library enabled presumption of a possible biosynthesis pathway of ArA in M.incisa.Codon usage analysis of 142 NRSs with 17798 codons in the predicted coding regions showed that the average G+C content level of the total codons was 55.39%,and that of the third position in base trimers was 66.42%,indicating a strong bias toward cytosine and/or guanosine in this algal genome.Among all synonymous codons,NAG was most favored,while NUA was most avoided.Phylogenic trees inferred from ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit genes and the extra partial sequences of 18S rRNA obtained from this library demonstrated that M.incisa belonged to Trebouxiophyceae and was significantly clustered with M.incisa SAG 2007,Lobosphaera tirolensis,M.bisecta,and Parietochloris incisa,but was clearly distant from P.pseudoalveolaris and P.alveolar.Transmission electron microscopy revealed pyrenoids traversed by many parallel thylakoids membranes,while starch grains were only clearly observed when cells were grown under nitrogen stress.Based on combined investigation of the phylogeny and morphological characteristics,it is proposed that M.incisa be kept in the genus Myrmecia in which there might be two parallel groups,one living freely and another symbiotic species.     

球茎甘蓝花托花柄组织培养及其植株再生

球茎甘蓝花托、花柄在ＭＳ＋２,４－Ｄ０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ１ｍｇ／Ｌ培养基上培养,诱导形成愈伤组织．愈伤组织在ＭＳ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ３ｍｇ／Ｌ的分化培养基上培养,能分化出芽．花托在附加６－ＢＡ和ＧＡ３的ＭＳ培养基上培养,能直接出芽．花柄在附加６－ＢＡ或６－ＢＡ和ＧＡ３的ＭＳ培养基上培养,能直接出芽．芽通过继代培养,能再生植株