桃树PpADC基因克隆及逆境胁迫表达分析

多胺广泛参与植物生长、发育等生理生化进程和植物逆境应答反应,精氨酸脱羧酶(ADC)是植物多胺生物合成途径中的关键酶.为研究桃树ADC基因的结构和逆境胁迫转录表达情况,试验利用同源序列法克隆桃树PpADC基因,对基因序列、编码蛋白结构等进行生物信息学分析,应用qRT-PCR检测基因PpADC在不同逆境胁迫过程中的转录表达量.结果表明,桃树PpADC基因含有一个2 178 bp的开放阅读框,编码725个氨基酸,基因序列中不含有内含子结构;该基因编码蛋白与白梨精氨酸脱羧酶相似值高达90.14%,系统进化树分析表明PpADC基因与白梨、苹果和湖北海棠等蔷薇科果树ADC基因亲缘关系较近;低温、脱水、盐和乙烯处理能不同程度上调PpADC基因的转录表达水平,表明该基因在桃树应答逆境胁迫过程中发挥重要作用.     

巴西橡胶树HbNAM基因克隆和表达分析

为了研究巴西橡胶树中植物特有NAC转录因子的功能,笔者通过RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对HbNAM的开放阅读框(ORF)进行了克隆和表达分析,并通过酵母转化实验进行转录激活活性分析。结果显示,HbNAM基因ORF为1 077 bp,编码358个氨基酸,在第12—167位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,属于NAC转录因子家族中的NAM亚族。酵母试验表明,HbNAM在高度变异C端具有转录激活活性,具备转录因子的基本特征。实时荧光定量PCR分析发现,HbNAM在叶片、雄花、雌花、胶乳和树皮中均表达,其中以光合组织叶片和生殖组织雄花中的表达量最高,并且胶乳中该基因的表达受割胶、植物激素或植物生长调节剂茉莉酸(JA)和乙烯利(ET)以及低温胁迫影响,推测HbNAM可能与植物的生长发育和胁迫应答过程有关。     

猪黑皮质素受体3和4基因克隆及分析

以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆长白猪黑皮质素受体3和4基因(MC3R和MC4R).序列分析显示:长白猪MC3R基因cDNA编码具319个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠和斑马鱼的氨基酸序列一致性分别为86.4%、83.3%、82%和69.7%;MC4R基因cDNA全长1175bp,编码具332个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠的氨基酸序列一致性高达94%以上,与斑马鱼MC4R氨基酸序列享有70.7%的同源性.序列分析显示,猪MC3R和MC4R基因都具有典型的七次跨膜结构域,和短的胞内环和胞外环,且在第五个跨膜域中保守的甲硫氨酸(M)分别替换为异亮氨酸(I)和缬氨酸(V).另外,在猪MC3R和MC4R中还鉴定到保守的半胱氨酸残基,第一个胞内环中保守的PMY基序和N末端的3个N-链接糖基化位点.组织表达图谱分析表明,MC3R主要在大脑和脾中高表达,而MC4R主要在六种检测的组织中都有表达,在肾中表达较弱.     

枸杞抗坏血酸氧化酶基因的克隆与表达分析

以枸杞为材料,利用同源克隆技术,克隆了枸杞抗坏血酸氧化酶(AO)的全长cDNA序列,命名为LcAO基因(GenBank:KP712033),该基因开放阅读框(ORF)大小为1737bp,编码578个氨基酸,与西红柿AO蛋白的同源性达到90%.LcAO编码的氨基酸序列包含3个多铜氧化酶结构域和跨膜信号序列.采用实时荧光定量PCR分析显示,LcAO基因在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少.     

茂原链霉菌谷氨酰胺转胺酶基因克隆、序列分析及原核表达

以茂原链霉菌(Streptomyces m obaraensis)的基因组DNA为模板,利用PCR的方法扩增出谷氨酰胺转胺酶(Transglutam inase,TGase)的完整基因片段.序列分析结果表明,该片段全长1 246 bp,包含一个完整的ORF,长度1 146 bp,编码395 aa,分子量为44 kD左右.该基因的核酸序列及推导的氨基酸序列同已知微生物来源的若干TGase相比,序列相似性均很高,并且发现与酶催化活性有关的一些motif,如酰胺化位点等;在此基础上,又进一步对其二级结构进行分析并完成了TGase三维结构的建模.将编码TGase酶的基因片段插入到原核表达载体pQE30Xa中,并转化大肠杆菌(E.coliJM109).SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导后该基因得到表达,表达产物的酶活为2.2 U/mL.     

野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

利用RT-PCR方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因,获得了其cDNA序列.该序列长2 317bp,含有一个2 295bp的完整开放阅读框,有8个外显子,7个内含子,编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的分子量和等电点分别为84 340.91和6.61.推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫(Laccase)基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明了该基因仅在野桑蚕的表皮、头部、中肠和血液中有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕漆酶基因的功能提供了分子基础.     

牦牛PKN2基因克隆与组织表达特性的分析

克隆牦牛蛋白激酶N2(Protein Kinase N2,PKN2)基因编码序列(Coding sequence, CDS),预测和分析PKN2基因的生物学特性,并探究在不同的组织中的表达规律.以牦牛的脂肪cDNA为模板,用PCR技术克隆PKN2基因;使用MEGA7.0、SOPMA和TMHMM等进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR技术PCR分析牦牛PKN2基因在心脏、肝脏、脾脏等组织的mRNA水平的表达.结果显示,PKN2基因CDS区长942 bp,编码313个氨基酸,分子量为107 315.25 u,分子式C₄₇₄₂H₇₅₃₅N₁₃₁₉O₁₄₄₂S₃₈;PKN2蛋白为不稳定的亲水蛋白,具有101个磷酸化位点;跨膜结构预测显示不存在跨膜结构区和信号肽;PKN2的二级结构主要以α-螺旋(41.61%)为主;与其他物种的同源性分析结果显示,牦牛PKN2基因与普通牛的同源性最高(99.84%),与鸡的同源性最低(84.59%),符合物种进化规律.qPCR技术显示PKN2基因在牦牛脂...     

原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂特性的研究进展

原卟啉原氧化酶(Protox/PPO)抑制剂类除草剂已成为一类广泛使用的除草剂.综述了原卟啉原氧化酶(Protox/PPO)抑制剂类除草剂产生与发展,杂草对其抗性机理、应用等方面的研究进展.     

猪Akt3基因克隆、序列分析及组织表达图谱研究

本研究以长白猪(Landrace)肌肉cDNA为模板,克隆得到长白猪Akt3基因.序列分析结果显示:长白猪Akt3基因cDNA全长1493bp,编码一个含479个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列一致性分别为100%、100%、99.58%、99.79%,具有高度保守性.氨基酸结构分析显示,长白猪Akt3基因都具有典型的Pleckstrin homologous domain(PH)结构域和丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活位点.组织表达图谱分析结果显示:Akt3基因在所有检测的家猪组织中均有表达.此外,本研究还将Akt3基因编码区序列克隆转入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,为下一步功能验证做准备.     

植物差异表达基因克隆技术及研究进展

随着分子生物学技术的深入发展,植物基因组研究已经由以全基因组测序为目标的结构基因组学转向以基因功能鉴定为目标的功能基因组学研究,目前分离并克隆差异表达基因已成为生命科学研究的热点.近些年来,国内外学者发展了多种分析差异表达基因的技术来研究植物在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况,掌握了生命活动过程中的重要信息.文章对建立在RNA水平上克隆植物未知差异表达基因的几种关键技术及其研究进展进行了综述,阐述了各技术的原理、技术路线、优缺点及相应的改进方法,并对它们在植物抗逆研究中的应用现状及前景作了展望.     

水杨酸对大丽花多酚氧化酶的影响

目的探讨如何提高大丽花的抗病性.方法以大丽花为实验材料,使用水杨酸(SA)叶面喷施处理方式,分析在水杨酸处理其植株叶片后,随时间变化,不同浓度的水杨酸对PPO活性的影响,为研究大丽花的抗病性提供实验依据.结果本品种大丽花的PPO最适pH为5.8;SA对大丽花PPO有一定的影响.用低于0.5 mmol/L的SA处理后的大丽花,PPO活性无显著影响;1～2 mmol/L的SA对PPO活性起促进作用,并且于24 h达到高峰;而3 mmol/L的SA对PPO活性起明显的抑制作用.而用以上几组浓度的SA处理大丽花后,PPO活性在48～60 h之后逐渐恢复到未处理状态.结论外源SA对大丽花进行处理后对PPO活性在一定时间内有诱导作用.     

甘蔗多酚氧化酶酶学特性及应用研究

对甘蔗多酚氧化酶(PPO)进行提取和部分纯化,研究了PPO的酶学特性.结果表明:以邻苯二酚为底物,甘蔗PPO酶促反应米氏常数Km为54.4 mmol/L,米氏方程:V=1250[S]/(54.4+[S]).蔗汁中邻位多酚类物质是甘蔗PPO的最适反应底物.最适反应条件为:pH值6.2,40℃;该酶在pH5.8和温度低于3℃0时较稳定.试验了6种甘蔗PPO抑制剂:单独使用柠檬酸、草酸、乙二胺四乙酸(EDTA)对PPO活力抑制效果不明显;70 mg/L亚硫酸氢钠、110 mg/L抗坏血酸、120 mg/L硫代硫酸钠可完全抑制PPO活力.现行甘蔗提汁的浸渗工艺较适合蔗汁酶促褐变反应,应作相应的调整.     

血管内皮抑素的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

血管内皮抑素不仅能特异性地抑制血管内皮生长，而且对血管形成和肿瘤生长也具有强烈的抑制作用。利用PCR法从人胎肝cDNA文库中克隆了人血管内皮抑素的编码序列，构建了重组质粒pRSendo，并在E.coli中表达，SDS－PAGE表明其表达产物为包涵体，此外，还对血管内皮抑素做了初步的纯化。     

人脑蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1基因克隆与原核表达

从人脑组织中提取mRNA,通过RT-PCR扩增出目标cDNA,构建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1-pEASY-E1重组质粒.将重组质粒转化进E.coli TOP10感受态细胞中,筛选阳性克隆进行验证,将测序正确的质粒转化到E.coli Transetta感受态细胞中表达SHP-1.进一步对SHP-1表达的诱导温度和IPTG浓度等条件进行优化.结果显示,所克隆的SHP-1基因片断经PCR鉴定和测序分析,与目标基因完全相符.通过蛋白表达条件的优化,发现20℃,0.4mmol/L IPTG对表达菌株进行诱导时,SHP-1可溶性蛋白表达量最大.     

人胰岛素样生长因子—I的基因克隆融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因,在序更测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃｌ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度的９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓ     

水稻OsWHY1基因克隆及过表达与RNAi载体构建

Whirly蛋白是一种单链DNA结合蛋白,是植物特有的存在于细胞核与叶绿体中的双定位蛋白.本研究以水稻品系金23B为材料,从cDNA中克隆得到水稻whirly蛋白基因(OsWHY1).该基因的c DNA全长为1 250 bp,开放阅读框大小为825 bp,编码274个氨基酸.结构域分析结果表明OsWHY1蛋白序列具有whirly蛋白家族共有的whirly结构域.蛋白质序列比对分析表明,OsWHY1蛋白序列与玉米(Zea mays),小米(Setaria italica),黍(Panicum miliaceum),高粱(Sorghum bicolor),大麦(Hordeum vulgare)的蛋白序列相似性分别为79. 8%、83. 1%、82. 7%、78. 7%和75. 3%.此外,本研究通过酶切酶连的方法成功构建了pU1300-OsWHY1过表达载体和PTCK303-OsWHY1 RNA干扰载体,为进一步研究OsWHY1基因在水稻持绿性中的功能打下基础.     

猪SOSC5和SOCS6基因克隆及组织表达研究

本文以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆得到长白猪细胞因子抑制因子SOCS-5基因和长白猪SOCS-6基因.序列分析结果显示:长白猪SOCS-5基因cDNA全长1688 bp,编码一个含有536个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列一致性分别为97％、97％、94％和95％;SOCS-6基因cDNA全长1645 bp,编码一个含有535个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性分别为:92％,97％,85％,82％.氨基酸结构分析显示,长白猪SOCS-5和SOCS-6基因都具有典型的中央SH2结构域和C末端有40个氨基酸的SOCS Box结构域;组织表达图谱分析结果显示:长白猪SOCS5基因在大脑、心脏、脾脏、肌肉组织大量表达,在下丘脑、肝脏、肾脏、小肠中也有表达;SOCS6基因在大脑、下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉及小肠均大量表达.此外,本研究还将SOCS-5和SOCS-6基因编码区序列克隆转入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,为下一步功能验证做准备.     

杉木ClWRKY44基因克隆及其表达特性分析

【目的】以杉木幼叶为试验材料,通过克隆杉木ClWRKY44基因,分析其表达特性,为揭示杉木抗逆生理的分子机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR技术克隆杉木ClWRKY44 基因,对其进行生物信息学分析和亚细胞定位研究,并利用实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。【结果】杉木ClWRKY44 基因的开放阅读框(ORF)为1 776 bp,编码591个氨基酸,具有WRKY结构域。系统进化树分析结果显示ClWRKY44 基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)ATWRKY44 的亲缘关系较密切,其在杉木的不同器官(叶、根、茎) 中均有表达,嫩叶中的表达量最高,茎中次之,根中最低。低温胁迫处理6 h,ClWRKY44 基因相对表达量最高,约是对照组的79.8倍。干旱胁迫处理24 h,ClWRKY44 基因在高浓度干旱胁迫处理下的相对表达量最高,约是对照组的46.6倍。【结论】杉木ClWRKY44基因编码的蛋白质序列与拟南芥ATWRKY44的同源性很高,在调控植物逆境胁迫应答过程中可以发挥功能,为杉木幼苗生长发育的适应性提供参考。     

甘蓝型油菜BnDHAR基因的克隆及表达分析

在甘蓝型油菜矮化突变体与其高秆亲本构建的消减杂交文库中,得到一长约230bp与编码脱氢抗坏血酸还原酶的DHAR基因核苷酸序列相似的DNA片段.采用同源克隆技术,在甘蓝型油菜中获得该基因的全长cDNA序列,命名为BnDHAR.BnDHAR与已公布的甘蓝型油菜基因组中的该基因核苷酸序列完全一致.对BnDHAR基因不同发育时期组织的表达分析的结果显示,BnDHAR基因在高秆油菜苗期的叶中表达量最高,是矮化突变体的5倍,在根、茎中表达极低,具有组织特异性.非生物胁迫显著影响BnDHAR表达,高温胁迫使其表达升高,盐胁迫处理9h时达最高,而干旱胁迫时表达量在处理12h时才达最高.