菊花‘千手观音’LEAFY基因转录区基因组克隆和结构分析

LEAFY(LFY)基因在植物花发育过程中具有重要作用,不仅控制着花序分生组织向花分生组织的转变,而且控制着开花时间.通过基因组PCR扩增,获得了菊花‘千手观音’LFY同源基因序列.序列分析表明该基因包括2个内含子和3个外显子.其内含子1的2个序列长短不同,差异明显.2个内含子与甘菊的LFY同源基因DFL相比都表现出了丰富的变异性.其外显子推测的氨基酸序列与甘菊DFL的氨基酸序列相似性达99%.系统进化分析表明‘千手观音’的LFY同源基因与所有的菊属植物的LFY基因在树的同一枝上,且距双子叶植物的距离近于单子叶或裸子植物.Southern杂交表明,‘千手观音’基因组中LFY同源基因以两个拷贝形式存在.     

烟草NFL1基因启动子区的克隆和初步的功能分析

植物的开花过程是一个复杂的发育过程,涉及到许多基因的表达和调控,其中LFY同源基因(LFY-like genes)发挥着重要的作用[1～7].在拟南芥中,LFY基因发生突变而失去功能后,花芽分生组织的形成受到显著的抑制[8];将LFY基因在植株中的表达水平提高后则可以有效地促进开花[9].     

簸箕柳SPL基因家族分析

【目的】确定SPL基因家族在不同物种之间的选择性保留和丢失情况,为后续研究被子植物花发育提供参考。【方法】通过在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、毛果杨(Populus trichocarpa)、簸箕柳(Salix suchowensis)、葡萄(Vitis vinifera)、番木瓜(Carica papaya)、水稻(Oryza sativa)6种被子植物基因组中查找SPL结构域,寻找6个物种的SPL同源序列。对所找到的SPL序列进行BLASTN比对鉴定同源基因类型。使用自编Perl脚本结合KaKs_Calculator计算SPL同源基因的非同义突变(K_a)以及同义突变(K_s)值,采用共线性分析确定该基因家族的复制和扩张方式。【结果】在6种被子植物基因组中,共发现120个SPL基因。根据种内和种间旁系同源、直系同源基因以及这些同源基因选择压的计算显示:杨柳科SPL同源基因最多,共有旁系同源基因24对,直系同源基因50对; 番木瓜没有旁系同源基因。6个物种中,木本植物比草本植物直系同源基因更多,双子叶植物比单子叶植物直系同源基因更多; 所有旁系同源和直系同源基因的K_a/K_s值均小于1。系统发育树的分析结果与基因同源性分析基本吻合,证明了这两种分析方法具有较高的可靠性。此次研究选取了簸箕柳同一植株上开花和不开花的枝条进行了转录组测序分析,差异表达分析发现了1个SPL基因(willow_GLEAN_10025160)在两种枝条的转录组中表达差异显著(P≤0.01),其在开花枝条中的表达量显著高于未开花枝条,该基因被选为SPL基因家族中参与簸箕柳开花调控的候选基因。【结论】通过对6个物种SPL基因家族的分析,发现6个物种中所有直系同源和旁系同源基因都经历了纯化选择(K_a/K_s<1),基因功能保守。这6个物种除了经历过全基因组复制事件,还发生过大规模的基因丢失或者通过其他方式产生的基因扩张,阐明了它们在进化历史上的复制事件及SPL基因在不同物种中的选择性保留与丢失情况,为进一步研究其在调控簸箕柳开花中的作用提供了有力证据。     

桃树抗寒相关的叶绿体新基因PpRBD1的克隆及特征分析

为确定桃树细胞质抗寒相关基因,依据模式植物拟南芥中抗寒相关的RBD1基因,结合桃基因组数据设计并克隆到一个桃PpRBD1基因。该基因全长2 230 bp,编码513个氨基酸;结构域分析显示,该氨基酸序列含有RRM(RNA recognition motif)保守结构域,是与拟南芥RBD1同源的蛋白;亚细胞定位预测表明,该基因编码的蛋白可能在叶绿体中表达。该基因可能在桃抵抗寒冷胁迫中发挥重要作用。     

等边浅蛤线粒体全基因组测序和系统发育研究

采用高通量测序技术对等边浅蛤的线粒体全基因组进行了测序,并通过拼接、组装得到了完整的线粒体基因组序列。研究结果表明:环状线粒体基因组总长度为20 248 bp,由13个蛋白编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因及1个控制区组成,所有基因均在重链编码。等边浅蛤线粒体基因碱基组成为A(28.55%),T(39.33%),C(10.40%)和G(21.72%),A+T含量为67.88%,具有AT偏好性。D-loop控制区位于COX1基因和Cytb基因之间,长度为1 944 bp。利用帘蛤科16个物种及缢蛏(外群)的线粒体基因组的12个蛋白质编码基因构建NJ系统进化树。结果表明,等边浅蛤与菲律宾蛤仔聚为一支,亲缘关系最近。该研究将补充浅蛤属线粒体基因组信息,为浅蛤属以及帘蛤科的系统发生关系及进化地位积累有价值的数据资料。     

甜菜夜蛾P450基因的克隆及组织特异性分析

为获得甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)P450基因序列并分析其分布的组织特异性,采用同源克隆结合RACE技术克隆得到了该基因的cDNA全序列:全长2565bp,包含1010bp的3’非编码区域和42bp的5’非编码区域,开放阅读框(ORF)长1515bp,编码504个氨基酸,分子量为57.74kD,理论等电点为8.01;包含2个糖基化位点,2～21aa为跨膜结构.同源比对结果表明,SeP450与其它昆虫的P450基因拥有同样的2个保守结构域:CAFG、AG\ET.SeP450与棉铃虫蛾HelicoverpaarmigeraP450同源性最高,达74％;系统发育分析也表明二者亲缘关系较近.同时RT-PCR结果显示SeP450mRNA在中肠、脂肪体等多种组织中都有表达,其中中肠表达量最高.     

银杏GbGGPS基因的克隆及序列分析

利用RACE技术克隆并获得了银杏牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GbGGPS基因).银杏GbGGPS基因的cDNA全长为1 641 bp,含有1个1 176 bp的可读框,编码391个氨基酸序列.生物信息学预测GbGGPS蛋白的分子质量为42.51 ku,理论等电点为5.98,N端有叶绿体信号肽,其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成.蛋白质同源分析表明,GbGGPS含有多聚异戊二烯基合成酶家族中保守的5个特征性结构域和2个富含天冬氨酸的区域.同源建模分析显示GbGGPS序列与薄荷GGPS蛋白的三维结构及活性位点高度相似.系统进化分析表明,银杏GGPS蛋白归属植物进化支,且与加拿大红豆杉、挪威云杉、北美冷杉的GGPS蛋白归为同一分支.     

南高丛蓝莓VcPCNA基因的分离及在果实发育进程中的表达分析

为探究VcPCNA基因在蓝莓果实发育过程中可能的调控机制,以南高丛蓝莓中果品种‘奥尼尔’与小果品种‘蓝雨’为实验材料,分离蓝莓VcPCNA基因全长cDNA,应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测VcPCNA基因在花芽膨大与果实发育进程中的表达规律.结果表明:VcPCNA基因开放阅读框全长795 bp,包含保守的PIN00057功能域,以及可与其他蛋白互作的结合基序PIP-box,共编码264个氨基酸残基,相对分子质量为29.3 kDa;VcPCNA基因在‘蓝雨’花芽膨大期间中表达持续下降,而在‘奥尼尔’花芽中呈先上升后下降的趋势,且在开花前期VcPCNA表达量均处于较低水平;在果实发育进程中,‘奥尼尔’与‘蓝雨’VcPCNA基因表达模式相似,在开花期维持较低水平,在细胞快速分裂的S1期迅速升高至峰值后降低.结果表明,VcPCNA基因是动植物中保守的细胞增殖相关基因,其表达与蓝莓花芽、果实的发育进程密切相关,但其调控机制仍需深入研究.     

乌塌菜叶绿素降解代谢调控相关基因BcNYE1的克隆和分析

采用电子克隆策略结合RT-PCR从乌塌菜中分离得到了AtNYE1的同源基因BcNYE1完整编码区序列,并对其进行基因组组成和功能研究.BcNYE1的开放阅读框(ORF)长870 bp,编码289个氨基酸残基;基因组序列全长为1 132 bp,有2个内含子和3个外显子.为了验证BcNYE1基因的功能,构建了植物双元表达载体pCHF4-BcNYE1,采用冻融法导入农杆菌GV1301,通过花蕾浸染法转化拟南芥滞绿突变体nye1-1.对所获得的卡那霉素抗性植株进行PCR、RT-PCR检测,结果表明,在得到的转基因株系中,BcNYE1基因已整合到受体植物基因组中,并且可以转录成mRNA.互补实验结果显示,BcNYE1基因不具备互补拟南芥滞绿突变体nye1-1叶绿素降解缺陷的功能.     

禾本科同源染色体对趋同进化的比较基因组学

多个禾本科物种全基因组测序的相继完成为禾本科植物基因组物理和遗传结构进化历史的研究提供了前所未有的良好机遇。以五个禾本科物种为研究对象,利用基因同源共线性方法对其基因组进行了比对分析,获得了物种的同源信息,并根据同源信息结合基因组同源结构分析,确定了物种基因组内和基因组间的同源染色体片段。比较分析同源染色体对上重复DNA片段之间的分子距离,初步揭示了禾本科植物同源染色体对间趋同进化规律,研究结果有助于理解染色体结构受非正常遗传重组影响的进化机制。     

SPL家族基因复制及功能分化分析

【目的】基因复制及随后的功能分化是基因组和物种演化的重要驱动力。植物特有的转录因子家族SPL(SQUAMOSA-promoter binding protein like)广泛参与调控植物生长发育及响应逆境胁迫,为研究重复基因的起源方式和进化命运提供了良好的研究系统。本研究对葡萄(Vitis vinifera)、番木瓜(Carica papaya)、毛果杨(Populus trichocarpa)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)4种模式植物的SPL基因家族开展基因复制及功能分化分析,为进一步研究SPL基因功能、预测种属特异性的功能基因提供系统进化角度的参考。【方法】利用SBP特征结构域,鉴定葡萄、番木瓜、毛果杨和拟南芥4种模式植物中SPL基因家族成员,并利用最大似然法构建系统进化树。基于物种内、物种间基因组共线性,分析SPL基因家族发生基因复制的方式及差异保留情况,并计算保留的SPL直系和旁系同源基因的同义、非同义替换率,分析功能分化情况。【结果】在4种模式植物中共鉴定出SPL基因73个,其中42个是miR156的靶基因。系统进化分析显示:73个SPL基因聚类为9个主要分支,miR156靶向SPL基因成簇聚集在6个主要分支;Clade I中SPL基因编码的2个锌指结构基序为C4和C₂HC,而其余8个分支中SPL基因的锌指结构基序由C3H和C₂HC组成。大规模基因组复制事件(片段复制或全基因组复制)是SPL基因家族发生基因重复的主要方式。根据基因组复制事件推算,15个古基因位点理论上应复制出的360个位点中,83.6%的重复位点发生丢失或演化成非SPL基因。本研究鉴定出旁系同源基因17对,直系同源基因27对,且所有旁系和直系同源基因的K_a/K_s(非同义替换率和同义替换率之比)值均小于1。【结论】在不同物种中保留下来的SPL直系同源基因受到较强的纯化选择,在功能上具有保守性;同一物种中保留下来的SPL旁系同源基因在进化过程中维持部分功能冗余,但在组织表达偏好性和蛋白功能上已呈现出不同形式的分化。     

龙眼FLO/LFY同源基因cDNA片段的克隆

根据不同植物FLO/LFY同源基因3'端保守序列,设计简并引物,运用RT-PCR技术在龙眼花芽总RNA中扩增得到长度为408bp的cDNA片段,命名为lonFLO.序列分析表明,该片段与金鱼草FLO、苹果AFL2、AFL1、拟南芥LFY有较高的核苷酸同源性,分别达98.8%,81.6%,81.1%和76.2%.     

棉花硫氧还蛋白基因GhWCRKC2-5参与开花调控的功能研究

目的 FLOWERING LOCUS T (FT)位于开花调控网络的中心,编码成花激素,不仅调控植物开花转变,还参与调控植物多方面的生长发育。硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)在植物的逆境胁迫中发挥着重要的生物学功能。方法我们前期克隆了一个棉花FT同源基因Gh FT1,利用酵母双杂技术筛选到一个与Gh FT1蛋白互作的硫氧还蛋白Gh WCRKC2-5。本研究采用RT-PCR技术从陆地棉中扩增了Gh WCRKC2-5基因的开放阅读框c DNA。该基因编码一个203个氨基酸的短肽,含有WCRKC保守氨基酸基序,为非典型的Trx。全基因组分析表明棉花中含有46个非典型的Trxs,系统进化分析显示Gh WCRKC2-5与Theobroma cacao的Tc WCRKC亲缘关系最近。q RT-PCR分析表明Gh WCRKC2-5基因在棉花根和花中表达较高,在茎、叶和顶端分生组织中表达较低;在纤维不同发育时期,Gh WCRKC2-5基因表达呈现出降低-升高-降低的趋势,在棉花开花后25 d时的纤维表达最高。结果在拟南芥中过量表达Gh WCRKC2-5基因,转基因拟南芥明显比野生型早花,并且转基因拟南芥的FT及开花通路中关键基因SUPPESSOR OF OVER EXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1)明显上调表达。利用病毒介导的基因沉默技术干扰Gh WCRKC2-5基因的表达,Gh WCRKC2-5沉默的植株比对照植株开花时间晚。结论 Gh WCRKC2-5基因在棉花的开花转变中起着重要作用,本研究为深入分析棉花开花调控机理奠定基础。     

黄杨绢野螟和四目扇野螟全线粒体基因组的测定与分析

通过PCR结合引物步移法测定了黄杨绢野螟Diaphaniaperspectalis(Walker,1859)和四目扇野螟Pleuroptya inferior(Hampson,1898)的全线粒体基因组序列,并对二者进行了初步分析。结果显示:黄杨绢野螟和四目扇野螟线粒体基因组全长分别是15 249bp和15 348bp,基因的组成和排列与其他已公布的螟蛾总科昆虫相同,均由13个蛋白质编码基因(PCGs)、22个转运RNA基因(tRNA)、2个核糖体RNA基因(rRNA)和1个长度可变的A+T富集区组成。13个蛋白质编码基因除COⅠ以CGA作为起始密码子外,其余均以ATN作为起始密码子。对于终止密码子的使用,除COⅠ、COⅡ、ND5存在不完全终止密码子T或TA外,其他均为完全终止密码子TAA。21个tRNA基因均可形成典型的三叶草二级结构,只有tRNASer(AGN)比较特殊,其二级结构缺失DHU臂,在该位置形成了一个环。黄杨绢野螟和四目扇野螟线粒体基因组的A+T富集区位于12S rRNA和tRNAMet之间,长度分别为344bp和366bp,A+T含量明显高于线粒体基因组中37个编码基因。此外,A+T富集区还存在一些保守序列、poly-T和poly-A结构以及串联重复序列。基于13个蛋白质编码基因采用最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)对螟蛾总科10个亚科进行初步的系统进化分析,两种结果均符合以往形态学和分子数据的研究结果。     

人spindlin 1基因全长cDNA的克隆与定位

利用分子克隆技术和生物信息学手段,克隆并命名了人spindlin 1 基因. 此基因cDNA全长4375?bp,含有236～949 bp完整开放读框,预测编码27?ku 的膜内蛋白. 新基因在核酸序列上与鼠spindlin基因有96%同源,其编码氨基酸序列与鼠spindlin蛋白98%同源. 生物信息学分析表明该基因定位于9q22.1-22.3 区域, 基因组DNA全长为52.3?kb,由5个外显子和4个内含子组成,内含子和外显子之间的剪切完全符合GT-AG法则. 利用绿色荧光蛋白与spindlin 1基因的融合蛋白表达载体转染COS-7细胞表明spindlin 1表达的蛋白定位于胞核,且转染后的细胞中较多见胞核形态的改变,例如出现双核或巨型核.     

翘嘴鳜线粒体基因组全序列的克隆与特征分析

通过直接测序的方法获得翘嘴鳜线粒体DNA基因组全序列(GenBank:JF972568).翘嘴鳜线粒体基因组全长为16 496 bp,其包含13个编码蛋白基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个Control region区域.整个翘嘴鳜线粒体DNA利用率非常高,仅仅只有32 bp的基因间隔和35 bp的基因重...     

斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

兰州鲇线粒体基因组序列结构及系统发育分析

利用GenBank中欧洲鲇的线粒体基因组序列, 设计出6对引物, 通过PCR扩增产物直接测序和引物行走(primer walking)法测定了兰州鲇的线粒体基因组序列, 并对其进行结构分析。兰州鲇线粒体基因组序列全长16524 bp, 包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和1个非编码区。用最大似然法对鲇形目11种鲇鱼线粒体基因组的13个蛋白质编码基因的核苷酸序列进行系统发育分析。结果显示, 兰州鲇首先跟其他鲇科鱼类聚为一支, 形成一个单系群, 位于系统发育关系树的中部。     

玉米两个亚基因组与C4途径的进化

玉米不仅是重要的粮食作物,同时也是重要的C4光合作用作物.通过对玉米中有关C4途径的基因与高粱基因进行比较分析以及构建相应的系统发育树,发现C4途径中3个关键酶基因的基因家族以及一个叶绿体蛋白酶基因,它们都具有独立的适应进化过程.另外,对玉米C4途径中两个亚基因组基因Maize1和Maize2给出了明确的定义,发现了在C4途径进化过程中两个亚基因组中同源基因丢失不均衡现象,即在C4途径中Maize1相对于Maize2保留了更多的基因.     

钝齿蟳线粒体基因组全序列测定及系统发育分析

线粒体基因组全序列为更好地理解分子进化和系统发育关系提供了重要信息。本研究首次测定了钝齿蟳的线粒体基因组全序列,其全长为15 910 bp,包括13个蛋白编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因和1个控制区。整个线粒体基因组的核苷酸组成为33.8%A、36.4%T、11.1%G及18.7%C,具有明显的AT偏向性(70.2%)。所有蛋白编码基因以ATN作为起始密码子,绝大多数蛋白编码基因以TAG或TAA作为终止密码子,少数以不完全密码子(T-)作为终止。除tRNA-Ser_1和tRNA-Thr分别缺失二氢尿嘧啶臂(DHU臂)和TΨC环外,其余所有的tRNA基因均能形成典型的三叶草结构。系统发育分析结果显示,蟳属所有物种都聚为一个类群,并与短桨蟹属有着最近的亲缘关系。这些结果将有助于更好地了解钝齿蟳线粒体基因组序列特征,并为研究梭子蟹科的系统发育关系奠定基础。