新生大鼠大脑皮层和海马神经元体外培养方法及改进

探索用24 h内新生SD大鼠进行神经元体外培养的方法.取新生SD大鼠的大脑皮层和海马,胰酶消化5～10 min后,放入含100 g/L血清的DMEM/F12培养基中培养.24 h后,更换含B27无血清培养基.以后每隔1d,半换液.结果显示绝大部分神经元于第2天长出突起,第3天神经元间形成复杂的联系,第7天神经元发育基本成熟.经神经元特异性烯醇酶(NSE)鉴定,培养细胞均为神经元,纯度可达90%以上,可以用于实验.     

大鼠海马神经元neurobasal无血清的原代培养方法

目的:建立纯度和活力较高的无血清原代培养海马神经元的方法。方法:新生SD大鼠海马,用neuro-basal培养基培养,免疫荧光鉴定神经元纯度,MTT法检测其活力。结果:神经元接种12~24 h后贴壁,并长出细小突起,3 d具有典型神经元形态特征,4 d突起形成稀疏的神经纤维网络,8 d后神经元5~10个聚集成团,突起密集,生长稳定,12 d后出现细胞碎片。Tubulin荧光染色显示清晰的神经元,突起绵长且相互交织,占细胞总数的66.7%;GFAP荧光染色的细胞数量少,突起短粗,占33.7%。培养1~5 d MTT代谢率逐渐上升,6~11 d处于平台期,11 d后下降。结论:neurobasal无血清培养获得的神经元纯度大于60%,6~11 d的细胞适于细胞学实验。     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

的探讨新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷（BMU）标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）、波形蛋白（Vimenfin）和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞（Tuj-1染色阳性细胞）、神经胶质细胞（Vimentin染色阳性细胞）和少突胶质细胞（GMc-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马神经干细胞。     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨新生大鼠海马神经干细胞(NSC)的体外培养和诱导分化的条件和特点.方法 分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27,联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法 行巢蛋白(Nestin)、5-溴脱氧尿苷(BrdU)、β-Ⅲ型微管蛋白(Tuj-1)、波形蛋白(Vimentin)和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定.结果 体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代.鉴定为Nestin染色阳性细胞和5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞(Tuj-1染色阳性细胞)、神经胶质细胞(Vimentin染色阳性细胞)和少突胶质细胞(Calc-C染色阳性细胞).结论 采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马神经干细胞.     

大鼠海马锥体神经元外向电流特征分析

利用全细胞膜片钳技术研究了大鼠海马锥体神经元去极化激活的外向电流的特征.结果表明,短时去极化至-60mV以上电位可引发快速上升的外向电流,之后缓慢衰减至一平台.当保持电位改变时,该峰电流与平台电流的幅度均会发生变化,但前者较后者变化显著.试验中测得峰电流与平台电流的逆转电位分别为-(76.1±5.97)mV和-(83.6±4.13)mV,与用Nerst方程计算出的本试验细胞外液与电极内液的钾离子平衡电位Ek=-88mV接近,说明该外向电流是钾电流,且提示此外向电流包括两种成分.试验结果还表明,此外向电流的衰减过程可用双指数方程很好地拟合,而在500ms预脉冲刺激后再经去极化激活的快成分的失活过程则适合用单指数方程进行拟合,从而进一步证实大鼠海马锥体神经元的外向钾电流包括快慢两种成分(IA和IK).IA的稳态激活和失活过程均可用Boltzmann方程进行拟合,半数激活和半数失活电压分别为(7.40±3.01)mV和-(66.27±3.62)mV,但其稳态失活在测试电压范围内(-100mV至+30mV)不完全.     

大鼠怀孕及哺乳期铅暴露致子鼠海马c-JUN表达的变化

通过观察大鼠怀孕期及哺乳期铅摄入致子鼠海马回c-jun的变化。用RT-PCR的方法分别检测大鼠怀孕期铅暴露后子鼠和母鼠哺乳期铅暴露后子鼠(子鼠出生早期经乳汁染铅后)脑海马组织的c-jun的变化。结果:大鼠怀孕早期和晚期铅暴露,子鼠出生2 d时海马的c-jun的表达明显受到抑制,出生后经哺乳低剂量铅暴露子鼠c-jun的表达受到明显抑制,而高剂量暴露的却增加了c-jun的表达,达对照组的3倍。子鼠出生4 d海马的c-jun的表达与对照组比较略高,且与出生2 d相比均有所增加。而出生后经哺乳高剂量铅暴露子鼠c-jun的表达依然明显高于对照组,达对照组的4倍。子鼠出生10 d海马的c-jun的表达较4 d时下降,但怀孕早期高剂量暴露组和晚期各暴露剂量均高于对照组。而出生后经哺乳暴露鼠c-jun的表达呈增多趋势,其中高剂量铅暴露子鼠c-jun的表达依然明显高于对照组,达对照组的近10倍。子鼠生后20 d时海马的c-jun的表达均显著增加,各剂量组呈现剂量效应,即随剂量增加表达增多,但表达量均低于对照组。结论:大鼠不同的铅暴露时间和强度对子鼠脑海马c-jun的表达变化不同,同时建立了RT-PCR的检测方法并在毒理学实验中进行了初步应用。     

大鼠皮层星形胶质细胞体外培养的对比研究

比较3种不同培养星形胶质细胞的方法,以获得高纯度星形胶质细胞,为体外研究其生物学功能奠定基础.取新生SD大鼠的皮层区,应用原代培养法、差速贴壁培养法和震荡法,通过形态学观察、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色法和台盼蓝染色法,对比分析3种不同培养方法所获得星形胶质细胞的纯度和活性.差速贴壁组星形胶质细胞纯度(98.4%)明显高于原代培养组和震荡组.经台盼蓝染色发现,各组细胞活细胞率均大于95%,表明3种培养方法对于细胞活性没有显著影响.差速贴壁培养法培养星形胶质细胞的方法具有简便可行,纯度高的优点,可作为星形胶质细胞体外培养的良好模型.     

当归对宫内缺氧新生大鼠海马CA3区神经元的影响

探讨宫内缺氧对新生大鼠海马CA3区神经元的影响及当归注射液的保护作用.将孕期14 d的SD大鼠随机分为对照组、缺氧组和当归治疗组.缺氧组孕鼠自孕第14 d开始每天一次经尾静脉注射生理盐水8 mL/kg(连续7 d),后用低张性缺氧模型致胚鼠宫内缺氧2 h(连续3 d:孕期第14 d、15 d、16 d);当归治疗组用250 g/L的当归注射液代替生理盐水,其余处理同缺氧组;对照组不缺氧,其余同缺氧组.孕鼠分娩后立即取新生鼠大脑组织,常规石蜡切片,经神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE)免疫组织化学染色后行图像分析.缺氧组新生鼠海马NSE免疫组化阳性细胞的积分光密度(Integrated Optical Density,IOD)值较对照组减少(IOD缺氧组:4.9±1.10;IOD对照组:6.2±1.59,P＜0.05);当归治疗组新生鼠海马NSE免疫组化阳性细胞的IOD值较缺氧组增加(IOD治疗组:6.9±2.60, P＜0.05).结论:一定程度的缺氧可刺激海马CA3区神经元变性;当归注射液对宫内缺氧新生大鼠海马CA3区神经元可能具有保护作用.     

Rho激酶影响大鼠海马神经元突起生长的实时成像

目的:观察Rho激酶对大鼠海马神经元突起生长的影响.方法:体外培养新生大鼠海马神经元5 d后,连续动态观察溶血性磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)及Rho激酶抑制剂Y-27632对神经元突起生长的影响.结果:对照组神经元一级突起迅速生长、延伸,不断发分支,形成丰富的二级、三级突起;用LPA处理后,神经元大部分突起进行性塌陷,一级突起逐渐缩短并且变细,二级、三级突起数量减少,且较细小;而预先用Y-27632处理后再加LPA,细胞突起塌陷的现象减少,神经元的突起不断分支、延伸,一级、二级、三级突起数量较LPA组增多且长度也增加.结论:Rho激酶参与LPA诱导海马神经元突起回缩的过程,抑制Rho激酶的活性可抑制LPA诱导的突起回缩.     

Rho激酶对大鼠海马神经元骨架相关蛋白mRNA表达的影响

目的:探讨Rho激酶对大鼠海马神经元突起生长和骨架相关蛋白mRNA表达的影响.方法:用Rho激酶的抑制剂Y-27632和激动剂溶血磷脂酸(LPA)干预海马神经元,观察突起的生长并用RT-PCR检测大鼠海马神经元神经丝结合蛋白(Dbn1)、微丝肌动蛋白(F-actin)、微管相关蛋白(Tau)、α-微管蛋白(α-tubulin) mRNA的表达.结果:用LPA干预2 h后突起从远端逐渐退缩,长度缩短,细小突起退缩明显;Y-27632干预2 h后细胞胞体和突起的远侧端新生出细小突起.RT-PCR实际扩增长度与设计长度相吻合.内参照β-actin电泳条带在不同分组灰度较均一,呈高表达.Dbn1呈较高水平表达,激动剂LPA组表达下降(P<0.05),抑制剂Y-27632组表达量增多(P<0.05);F-actin和Tau表达呈低水平,激动剂作用后均使表达量相应的减少(P<0.05),抑制剂组表达增多(P<0.05);α-tubulin表达量最高,激动剂组表达量出现明显下降(P<0.05),抑制剂组表达增加(P<0.05).结论:激活Rho激酶下调Dbn、F-actin、Tau、α-tubulin mRNA的表达并诱导突起缩短,抑制则增加其表达并促进突起生长.     

大鼠原始生殖细胞的分离培养

以不同日龄的大鼠胎仔为材料，对其生殖巢进行解剖分离，并作形态观察．结果发现随着日龄的增加，生殖巢由长变短，由薄增厚，并在１４．５ｄ的生殖巢上发现了明显的性分化．对不同日龄的生殖巢用ＥＤＴＡ－Ｔｒｙｐｓｉｎ在３７℃下进行解离，可以得到原始生殖细胞（ＰＧＣｓ），较早日龄的ＰＧＣｓ形态较不规则，有大量的伪足伸出，运动能力较强．随着日龄的增大，ＰＧＣｓ的形态有所变化，椭圆形、圆形居多，并且运动能力亦有所下降．ＰＧＣｓ的体积比一般的体细胞大，细胞核多为圆形，体积硕大，有多个核仁．将消化液处理后的产物进行培养，ＰＧＣｓ一般能在含血清的ＤＭＥＭ培养液中悬浮生存一周左右，在此期间也有部分ＰＧＣｓ发生皱缩死亡，大量的体细胞在皿底成纤维化，血细胞逐渐死亡．     

新生大鼠神经干细胞分离培养及缺氧损伤模型的建立

目的建立缺氧损伤模型,观察缺氧损伤对神经干细胞分化的影响。方法用MTT,LDH等方法比较95%N2,5%CO2比率的缺氧气体分别培养1,2,4,6,8 h神经干细胞的变化。结果三天内的大鼠海马存在大量神经干细胞,可分化为神经元、胶质细胞等神经细胞类型,95%N2,5%CO2比率的缺氧气体培养6 h后神经干细胞OD值由缺氧前0.369±0.352降至0.270±0.229,LDH 漏出量由缺氧前10.374±0.390 unit/ml.min增加到14.710±1.337 unit/ml.min,差异显著。结论证实了新生大鼠海马内提取的细胞为神经干细胞,神经干细胞缺氧培养6 h可以建立神经干细胞缺氧损伤模型,但短时间缺氧培养对细胞分化类型无明显改变。     

大鼠美解眠点燃效应的形成与海马神经元凋亡

大鼠美解眠点燃效应的形成与海马神经元凋亡刘新峰金泳清陈光辉张隽吴波＊南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院神经内科（南京，２１０００２）＊病理科关键词大鼠；美解眠；海马；点燃效应，神经元凋亡分类号Ｒ９７１．７０引言美解眠是一种速效的中枢兴奋剂，可...     

HO-1蛋白在大鼠海马神经元中的发育

通过免疫组化及流式细胞仪计数等方法,观察生后P0～P300大鼠海马中血红素氧化酶-1蛋白阳性细胞的形态、数量与比例变化,研究血红素氧化酶-1蛋白在大鼠海马中的发育表达．结果表明：血红素氧化酶-1蛋白阳性细胞高峰出现在P14～P21之间,包括海马CA1,CA2 CA3,DG区,P0,P7,P30,P90 P300血红素氧化酶-1蛋白逐渐减弱．结果提示：血红素氧化酶-1在大鼠海马发育过程中的表达,可能受到海马特殊区域中不同类型细胞的调节．     

大鼠脑黑质直接注射Aβ引起多巴胺神经元丢失

β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积是AD病人脑内老年斑周边神经元变性和死亡的主要原因,帕金森病伴痴呆症也与Aβ的沉积相关。该研究直接将Aβ注射到大鼠脑黑质区,通过免疫染色与脑黑质TH-Positivc的神经元统计计数,来检测Aβ对多巴胺神经元损伤及小胶质细胞的激活情况。     

NaNO_3对人肺A549细胞和大鼠海马神经元的毒性研究

为了研究NaNO3对人肺A549细胞以及大鼠海马神经元细胞的毒性作用,用不同浓度NaNO3(10、30、100、300和1 000μmol/L)分别对大鼠原代培养海马神经元和A549细胞进行24h暴露处理,考察了不同处理组细胞中即早基因c-fos和c-jun以及凋亡基因p53,bax和bcl-2mRNA的表达变化情况。结果显示,NaNO3处理可诱导A549细胞c-fos和c-jun基因表达的增加,bax/bcl-2mRNA比值也呈上升趋势;同时,不同浓度NaNO3可明显上调大鼠海马神经元bax/bcl-2mRNA比值,而对p53mRNA表达无明显影响。由此推断,NaNO3可能会通过刺激即早基因和其下游凋亡调控基因的表达引起肺和脑的损伤效应。     

大鼠端脑神经元型一氧化氮合酶免疫阳性神经元的分析

目的：观察大鼠端脑神经元一氧化氮合酶（nNOS）免疫阳性神经元的分析。方法：ABC免疫细胞化学显示大鼠端脑nNOS阳性神经元。结果：nNOS阳性神经元呈棕褐色，胞体的形态多样化，呈梭形、三角形、圆形等多种形状，突起一个或多个；阳性纤维呈棕色串珠状，个别脑区阳性纤维相互交织成网。端脑nNOS免疫阳性神经元主要分布于嗅结节（包括海马回）、梨状区（包括梨状皮质和梨状核）、斜角带、隔区、杏仁复合体、海马结构、尾壳核和苍白球，以及大脑皮质等各个部位，其中以大脑皮质、梨状区和斜角带、尾壳核等部分最为丰富。结论：大鼠端脑内分布有丰富的nNOS阳性神经元，它们可能通过调节神经递质的分泌，参与脑的高级整合功能。     

小鼠海马神经元急性分离和膜片钳技术的应用

为了获得适用于膜片钳实验技术的单个海马神经元,应用酶消化及机械分离法,急性分离出生10～13d的昆明小鼠得到单个海马神经元通过倒置显微镜直接观察和全细胞膜片钳技术分别对分离得到的海马细胞的形态学和电生理学特征进行研究．通过实验可得,急性分离所得活性较好的海马神经元胞体具有锥形胞体和顸树突特征,立体感强．在全细胞膜片钳记录模式下可记录到全细胞电流及钠、钾通道电流．由实验结果可知,该方法可以得到形态和生理特征良好的单个海马神经元,证实该方法适用于膜片钳技术的研究,对深入探讨药物、物理因子等对海马离子通道及信号转导机制的作用有重要的应用价值．     

10-HDA对原代培养大鼠海马神经元增殖的研究

研究10-HDA对原代培养新生大鼠海马神经元的增殖效果.原代培养24 h的新生大鼠海马神经元,通过添加不同浓度的10-HDA(0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、10 μmol/L)作用后,利用BrdU免疫荧光染色检测神经细胞增殖,尼氏染色观察神经元数量的变化.结果显示中剂量浓度(1.0 μmol/L)的10-HDA作用海马神经元24h后,细胞数量明显增多;而高浓度(10 μmol/L)10-HDA作用海马神经元24 h后,细胞数量明显低于正常对照组和低剂量组(0.1 μmol/L).BrdU免疫荧光染色表明,中剂量浓度的10-HDA可使细胞增殖,增殖率达到(19.37±2.192 1)%.尼氏染色结果表明,10-HDA使海马神经元数量增加了(20.31±4.086 5)%.研究结果表明,10-HDA对原代培养的海马神经元有增殖作用.     

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经元退行性变方式的超微结构

目的：利用电镜技术研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后神经元退行性变方式。方法：对7日龄SD大鼠采用左侧颈总动脉永久性结扎联合体积分数为7,7％低氧吸人1h复制模型。分别在复氧后4、24、72h及1周取材,观察左侧海马皮质部退行性变神经元的超微结构。结果：神经元退行性变形式包括坏死、杂合体、凋亡、脂性退变及暗细胞。结论：新生大鼠缺氧缺血脑损伤神经元退行性变形式多样。