雅致放射毛霉AS3.2778碱性蛋白酶的纯化及水解特性

毛霉蛋白酶可以高效地水解大豆蛋白,而且对蛋白水解物具有良好的脱苦效果.为了开发这一蛋白酶系,采用离子交换、疏水层析及凝胶层析等方法,从雅致放射毛霉AS3.2778的发酵麸曲中分离纯化出一蛋白酶组分,并对其水解特性进行了探讨.结果显示：纯化后的蛋白酶是一单体蛋白,其相对分子质量大约为32000;该蛋白酶在55℃、pH8.0-10.0的条件下对大豆蛋白显示出较强的水解能力,其水解效果明显优于商品化的蛋白酶（如木瓜蛋白酶、Alcalase及Protamex）,表明该蛋白酶比以上几种商品化蛋白酶具有更广泛的肽键选择性,对大豆蛋白亲和力更强,在大豆蛋白肽链上有相对较多的酶切位点.     

雅致放射毛霉蛋白酶SP1基因的克隆及序列分析

雅致放射毛霉蛋白酶具有较好的脱苦味和水解豆类蛋白的能力.为了揭示其结构和功能的关系,促进其开发应用,文中通过RACE和PCR技术克隆获得丝氨酸蛋白酶SP1基因.根据生物信息学中的理论和方法,对SP1进行了较全面的预测和分析.结果表明:SP1基因由4个外显子和3个内含子组成,编码454个氨基酸残基.SP1属于蛋白酶K家族,与Rhizopus microsporus var.chinensis的丝氨酸蛋白酶同源性最高,亲缘关系最近.以蛋白酶K晶体结构(PDB code:1IC6)作为模板进行同源建模,通过对模拟结构的分析可知:SP1分子内无二硫键,具有1个Ca2+结合位点;SP1与蛋白酶K在底物结合区域、氢键、盐键和二硫键等方面均存在差异,这些差异可能就是SP1具有独特的水解作用和脱苦能力的原因.     

培养基组成对雅致放射毛霉发酵生产壳聚糖的影响

研究了发酵培养基中不同碳源、氮源、无机盐对雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)合成壳聚糖的影响.采用单因素和响应面法优化了发酵培养基中玉米粉和玉米浆这两种主要成分的最佳添加量组合.结果表明,最佳培养基组成为(g/L):玉米浆68,玉米粉液化液42,KH2PO4 2,MgSO4 2.采用优化后的培养基,壳聚糖产量最大达到2.223,g/L,比优化前提高了64.30%.     

时间及温度对腐乳毛霉生长及产蛋白酶的影响

研究了曲种培养时间、培养温度及培养基成分对腐乳毛霉菌丝生长及产蛋白酶的影响．结果表明,在25℃左右恒温培养36～48h,菌丝生长良好,孢子产生少,蛋白酶产量尤其是酸性蛋白酶产量较高;麦麸豆粉培养基比单纯麦麸培养基利于毛霉菌丝生长及产酶．合理选择培养时间、培养温度及培养基成分,对腐乳毛霉的生长及蛋白酶的适度产生有较好的效果．     

高产胞外蛋白酶毛霉的筛选及酶学性质研究

通过平板初筛和发酵复筛从保藏的16种毛霉菌株中筛选出了四株高产胞外蛋白酶毛霉菌株,分别为3.4906、3.4909、3.4943和3.5009。筛选过程中发现平板筛选法用于毛霉筛选不易观察,需改进方法,发酵法仍是最直接有效筛选的方法。对四株毛霉所产蛋白酶酶学特性研究发现,在温度耐受性方面,3.4943和3.4906的蛋白酶耐温性强;在反应温度方面,3.4906和3.5009的最适反应温度较低,3.4943和3.4909的最适反应温度较高;在反应p H方面,4种毛霉所产蛋白酶的最适p H在6.0~8.0范围;在受Na Cl浓度影响方面,3.4943的酶活力受Nacl浓度影响较大,3.4909的酶活力受Na Cl浓度影响最小。各菌株的酶学特性存在差异,根据发酵食品的工艺特性选择适宜的菌株。     

酱曲源毛霉的分离及其产蛋白酶条件的优化

利用稀释平板法从曲样和窖泥单菌落中分离得到2株毛霉1#和2#,在优化的发酵培养基和发酵条件下产蛋白酶活力分别达到:1#菌6 565 U/g,2#菌9 146 U/g.对两株菌进行紫外诱变,获得的诱变U1#菌、U2#菌分别比出发1#菌、2#菌产蛋白酶活力提高了48.58%和54.45%.     

碱性蛋白酶交联酶晶体的制备及稳定性

研究了用透析平衡法制备碱性蛋白酶晶体的过程,在硫酸铵饱和度为２５％的条件下获得了符合要求的碱性蛋白酶晶体,然后采用戊二醛进行交联,制备出了交联酶晶体,并对其在高酸碱度、高温、有机溶剂或有机溶液中的稳定性进行了研究．实验结果表明,交联酶晶体有较高的稳定性．     

海洋弧菌碱性蛋白酶的分离纯化及部分性质研究

采用硫酸铵沉淀、Sephadex-75,Sephadex-100凝胶过滤层析等方法纯化海洋弧菌（Vibrio pacini)X4B-7菌株产生的碱性蛋白酶，得到电泳纯酶制品，并对纯化酶的性质进行了研究。结果显示：纯酶的分子量为27KD，等电点pI=8.7,最适反应pH9.0-10.5，最适反应温度50－60℃。EDTA对酶活力没有影响，高酶浓度可以降低SDS对酶的抑制作用，该酶可用于解聚组蛋白。DNA琼脂糖凝胶电泳证明：酶对DNA酶有降解作用，而对DNA没有降解作用，该酶有希望应用于核酸的提取。     

枯草杆菌AS1．398制备中性蛋白酶的研究

本文研究了枯草杆菌ＡＳ１．３９８发酵培养制备中性蛋白酶，对发酵培养基配比，培养条件，金属离子的影响等进行了摇瓶试验。制备的ＡＳ１．３９８中性蛋白酶有如下性质：最适ＰＨ７．２－７．４，在ＰＨ６．５－８．０稳定。最适温度４２－４４℃，３５℃下处理２小时能保持约８５％酶活力，６０℃下１０分钟酶完全失活，此酶被ＥＤＴＡ和Ｃｕ２＋所抑制     

碱性蛋白酶交联聚集体的制备及其催化性能研究

碱性蛋白酶在食品、医药、酿造、丝绸、皮革等行业中发挥着重要作用。制备了碱性蛋白酶交联体,并对其催化性能进行研究。在最佳制备条件下(90%叔丁醇作为沉淀剂,沉淀时间为15min,交联剂浓度为33mmol/L,交联时间为6h),交联酶的酶活回收率为22.6%。与游离酶相比,交联酶的最适pH值向碱性方向变化,由7.5变为8.0,最适温度由60℃变成65℃。酶动力学研究表明,交联酶对酪蛋白的催化水解能力(4.3min-1)比游离酶(3.7min-1)更高。尽管交联酶最大反应速度V_max(9.8mg/(mL·min))低于游离酶(13.3mg/(mL·min)),但交联酶对底物的亲和力K_m(2.3mg/mL)比游离酶(3.6mg/mL)有所增加,而且其热稳定性和酸碱稳定性都得到一定程度的提高。另外,在磷酸盐缓冲液中重复使用5和8批次后,交联酶还能保持82.5%和56.5%的酶活性。     

苦荞类胰蛋白酶水解酶的纯化及部分性质研究

采用缓冲液提取、盐析、凝胶过滤及离子交换层析等方法，从苦荞种子中分离纯化出1种类胰蛋白酶水解酶，经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)测得其分于量为67kD，等电聚焦(IEF)测得等电点为6．3．该酶可以水解胰蛋白酶的底物BApNA，而且其活性不受苦荞胰蛋白酶抑制剂的影响．通过比较，苦荞中的胰蛋白酶水解酶在性质上与报道的甜荞BAPAase极为相似，可能属于同一类蛋白酶．     

碱性蛋白酶产生菌黄假单孢菌的分离、鉴定和产酶条件研究

从湖北黄石市的土样中分离到一种黄色假单孢菌,它产生碱性中温度白酶,酶活为１．０７＊１０＾－６ｍｏｌ．ｓ＾－１,该菌的最适产酶时间为４８－６０ｈ,最适产酶ＰＨ值为１１．０,最适产酶温度为３０－３５℃。该菌对氨苄青霉素和硫酸链霉素每天则对壮观霉素有抗性。     

一株产碱性蛋白酶菌株的分离与鉴定

从黄石市土壤中分离到一株产碱性蛋白酶的革兰氏阴性杆菌,不产芽抱,具美膜．能在ｐＨ９－１１条件下生长、产酶．产酶最适ｐＨ值为９,最适温度为３７℃,适发酵时间为３６ｈ．发酵产酶量为４５．０Ｕ·ｍＬ－１根据实验结果,该菌株鉴定为毛状假单抱菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｌａｓｉａ．     

黄鳝肠道蛋白酶的应用研究

将黄鳝内脏混合物提取液作同工酶电泳,得到3条蛋白酶同工酶条带,其中ProteaseⅠ条带与从黄鳝肠道中提取的蛋白酶纯品SDS-PAGE条带重合,表明从黄鳝内脏混合物中可以提取到黄鳝肠道蛋白酶纯品.金属离子Cu2 和Ba2 对酶有激活作用,EDTA、Mn2 、Pb2 对酶有抑制作用,而Ca2 、Mg2 、K 、Na 对酶活性无明显影响.通过酶与化学试剂的配伍试验测得:CO23-、SO32-、硼砂对酶活性无影响,甘露醇、橄榄油、聚乙烯醇对酶活性有轻微抑制作用,SO42-、H2PO4-、BO32-和海藻酸钠对酶有轻微激活作用,而洗涤剂中常用的表面活性剂SDS、LAS、CHAPS和TritonX-100在低浓度时对酶活性无明显影响,酶在0·02%的SDS、0·05%的LAS和0·1%的CHAPS中保持相对稳定,40min酶活保持在50%左右.酶专一底物测试结果表明:黄鳝肠道蛋白酶对弹性蛋白酶的专一底物刚果红弹性蛋白(elastin-CongoRed)有水解活性,而对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的专一底物N苯甲酰L精氨酸乙酯(BAEE)和N乙酰L酪氨酸乙酯(ATEE)无水解活性,表明黄鳝肠道蛋白酶为弹性蛋白酶.     

嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3蛋白酶基因的原核表达、纯化和性质表征

将来源于嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3的蛋白酶(PH1704)基因在大肠杆菌BLP-CodonPlus中高效表达.采用超声、热失活和HiTrap Q Sepharose柱层析等方法对产物进行分离纯化.通过SDS-PAGE,Native-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,发现该重组酶以十二聚体为主的寡聚体形式存在,并具有SDS抗性.蛋白酶活力染色表明,其六聚体以上有活力.以azo-gelation为底物,对其酶学性质进行初步研究表明,其最适温度为85℃,最适pH=8.0,并且具有良好的热稳定性.