β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

眉斑并脊天牛纤维素酶性质的研究

为了了解眉斑并脊天牛(Glenea cantor)纤维素酶的性质,选取以木棉树(Bombax ceiba)为食的眉斑并脊天牛为研究对象,按照IUPAC的标准测定方法,测定和定位眉斑并脊天牛肠道中的内切-β-1,4葡聚糖酶、纤维二糖酶以及滤纸酶活力,考察内切-β-1,4葡聚糖酶的最适pH值和最适温度.结果表明:在眉斑并脊...     

阴沟肠杆菌一个内切纤维素酶Cel8A的克隆和功能证实

【目的】为了解决纤维素的酶水解问题,分析能水解纤维素的微生物的相关基因。【方法】从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的基因组数据中挖掘纤维素酶相关基因,发现开放读码框Cel8A和纤维素酶基因序列具有高相似性。利用重组表达技术在大肠杆菌中对Cel8A基因进行表达,纯化重组蛋白质并对该蛋白质进行功能鉴定。【结果】Cel8A蛋白质能水解羧甲基纤维素钠,它具有β-1,4-内切葡聚糖酶的水解特性。Cel8A的最适反应pH值为7.0,最适温度为40℃。【结论】成功克隆表达阴沟肠杆菌的Cel8A基因,并证实该基因编码的蛋白质具有β-1,4-内切葡聚糖酶活性,为进一步研究阴沟肠杆菌的纤维素酶组成以及纤维素降解机理奠定了基础。     

米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042内切型纤维素酶的分离纯化与鉴定

为了解米曲霉纤维素酶在物料分解过程中的作用,从米曲霉沪酿3.042成曲中提取粗酶液,利用DNS法分析了粗酶液中外切酶、内切酶及β-葡萄糖苷酶的活力.用刚果红染色法确定了沪酿3.042成曲粗酶液中含有4种内切型纤维素酶,分别称为Cx酶Ⅰ,Cx酶Ⅱ,Cx酶Ⅲ和Cx酶Ⅳ.经DEAE-Cellulose-52离子交换层析,0.15,0.20,0.25,0.30mol/L NaCl洗脱峰均测得内切型纤维素酶活性,制备电泳纯化得到4个内切型纤维素酶组分,SDS-PAGE结果显示,Cx酶Ⅰ,Cx酶Ⅱ,Cx酶Ⅲ为单体酶,分子质量分别为31 800,34 000,26 000u,Cx酶Ⅳ含有4个亚基,分子质量分别为14 000,23 600,26 000,33 500u.粗酶液中内切型纤维素酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为4.0.     

纺织用嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达、纯化与酶学性质

首先从Pyrococcus horikoshii中克隆出编码热稳定性的内切纤维素酶基因,以载体pet21a为表达质粒,构建重组质粒pet21a-1171,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys中进行表达,目的基因得到明显的可溶性表达,通过加热变性处理和离心后,重组酶纯度达到80%以上,随后对加热处理后的粗酶液进行简单酶活测定,结果表明,最适反应温度为95℃,与国外文献报道相一致,嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶成功得到重组可溶性表达。     

产朊假丝酵母细胞壁33kD蛋白的酶学特性研究

培养产朊假丝酵母菌收获菌体,经裂解酶处理细胞壁,离心后得到上清粒酶液,粗酶波经DEAE-纤维素层析、Sepharose4B凝胶过滤纯化。对33kD蛋白的酶学性质研究表明,反应最适pH为5．5,反应的最适温度为45℃。热稳定性较差,50℃温度下放置1h活力下降50％。主要水解β-1,3-倍苦键,具有较强的专一性,是一种典型的葡聚糖内切酶（对pNPG无作用）。     

极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的基因克隆、表达和酶学性质的研究

极耐热酶在工业生产中有可观的潜在用途，为此从极端嗜热厌氧细菌海柄热袍菌中通过PCR方法克隆出Cel12B基因，构建重组表达质粒pET-20b-Cel12B，转化至大肠杆菌JM109（DE3）诱导表达后，获得极耐热重组内切葡聚糖酶．经过热处理和组氨酸亲和层析柱纯化，获得电泳纯单一条带，酶学性质测定表明：最适作用pH为6．0，最适作用温度90℃，在pH5．3～6.5之间酶活力稳定，90℃半衰期70min。     

瑞氏木霉β-内切葡聚糖酶的纯化及其部分酶学性质研究

 利用盐析、SephadexG-75和DEAE-SephadexA50层析,从瑞氏木霉TrichodermareeseiQM9414发酵液中纯化了2个具有β-内切葡聚糖酶活性的组分Eg1和Eg2,分子质量分别为65.47ku和57.04ku.其最适温度分别为50℃和55℃,最适pH分别为4.8和5.0,米氏常数Km分别为3.76×10^-2g/L和4.20×10^-2g/L.根据其酶学性质,这是一类不同于已有的β-内切葡聚糖酶,为瑞氏木霉T.reeseiQM9414所产β-内切葡聚糖酶的进一步研究奠定了基础.     

芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

库拉索芦荟叶皮经匀浆、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose fast flow层析和Superdex-200prep grade层析,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,BGL).纯化结果是β-葡萄糖苷酶比活力为98.48U/mg,纯化倍数为328.27倍,酶活性回收率为9.87%,全酶分子质量约为69.3kD,亚基分子质量约为69.7kD.酶学性质研究表明:β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和5.0;在20~30℃及pH4.0~8.0范围内稳定性较好;最适条件下,以pNPG为底物的K_m值为2.21mmol/L,V_(max)为1.381μmol/(min·L).乙醇,抗坏血酸,Mn~(2+),K~+对该酶活性具有激活作用;SDS,Cu~(2+)对该酶活性具有强烈抑制作用;异丙醇,EDTA,尿素,Mg~(2+),Li+对该酶活性影响较小;甲醇对该酶有双重作用.     

镰孢菌属Q7-31菌株产耐碱性木聚糖酶的酶学性质

对镰孢菌属Q7-31菌株所产木聚糖酶的粗酶液和部分纯化后的酶液进行了酶学性质比较试验。其粗酶液的最适反应pH为6.0,温度50℃;稳定范围:pH6.0,温度30℃。粗酶液经部分纯化后酶液的最适反应pH5.0～6.0,温度为40～50℃;稳定范围:pH5.0～6.0,温度30～40℃。纯化后酶液的酶学性质明显优于粗酶液。     

嗜热侧孢霉2441纤维素酶产酶条件优化及突变株选育

为了提高嗜热侧孢霉2441纤维素酶的产量,对产酶条件进行了优化,测定了酶的特性,对选育抗葡萄糖效应突变株和中温型突变株进行了探索.实验中酶活力测定以微晶纤维素、CMC-Na和水杨苷为底物,DNS法测定还原糖;产酶条件优化采用正交试验设计,以微晶纤维素酶活为指标;通过NTG诱变和UV诱变选育抗葡萄糖效应突变株和中温型突变株.结果表明:产酶条件优化后,嗜热侧孢霉2441的纤维素酶活极显著提高(P0.01);2441的微晶纤维素酶、CMC-Na酶和β-葡萄糖苷酶的最适作用温度分别为60℃、65℃、70℃,最适作用pH值均为5.5,温度高于70℃及碱性条件下,酶活力显著下降;选育的抗葡萄糖效应突变株N20-01,微晶纤维素酶活提高13.203%,CMC-Na酶活提高47.176%,β-葡萄糖苷酶活提高119.517%;选育的中温型突变株U40-03,在32℃培养时与2441在45℃培养时相比,微晶纤维素酶活提高11.411%,CMC-Na酶活提高29.484%,β-葡萄糖苷酶活提高54.759%.     

灰绿曲霉产纤维素酶的研究

灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)发酵液通过硫酸铵盐析、Sephadex G-100分子筛、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析,分离纯化一种外切葡聚糖酶(CBH)和一种内切葡聚糖酶(EG).通过SDS-PAGE和凝胶柱层析法测定分子质量表明:CBH全酶分子质量为71 ku,由两个分子质量为35 ku的同型亚基组成;EG为单体蛋白,全酶分子质量为32 ku.酶学性质研究表明:CBH催化pNPC的最适pH为6.0,最适温度为55 ℃,酶活在pH 5.0～8.0 区间和温度低于55 ℃时稳定;EG催化CMC-Na的最适pH为4.0,最适温度为50 ℃,酶活在pH 3.5～7.5区间和温度低于65 ℃时稳定.Na+、K+、Ba2+、Mg2+以及NO-3和SO2-4对CBH和EG酶活均无影响;Ca2+和Mn2+对CBH有激活作用,Fe2+和Mn2+对EG有激活作用,而Zn2+、Cd2+和Cu2+对CBH和EG均有不同程度的抑制效应.酶动力学分析表明:CBH催化pNPC水解的米氏常数Km值为1.4 mmol/L(pH 6.0,55 ℃),EG催化CMC-Na水解的米氏常数Km值为5.0 mg/mL(pH 4.0,50 ℃).     

pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的酶催化动力学模型

pH值是影响酶催化反应速率的重要因素之一，建立动力学模型有助于定量分析酶解反应。经典的“三状态”动力学模型未考虑pH值对底物解离状态的影响及产物抑制的作用，该文对“三状态”动力学模型进行改进。在一系列假设基础上提出绿色木霉产纤维素酶水解羧甲基纤维素钠（CMC-Na）的反应机理，建立了pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的动力学模型，推导出反应速率表达式。Lineweaver-Burk作图法求得内切β-葡聚糖苷酶水解CMC-Na在不同pH的动力学参数：K＇m和V＇max，试验最佳初始pH值与模型计算pH值符合，从而模型得以验证。     

番薯过氧化物酶的分离纯化及其性质研究

从番薯皮中分离和纯化番薯过氧化物酶,对其酶学性质进行表征,分析了温度、pH对酶促反应的影响,考查了酶的热稳定性、酸碱稳定性.分离纯化过程包括匀浆、水提、双水相萃取、Sepharose CL-6B凝胶层析、Phenyl Sepharose 6 fast flow疏水层析、Con A Sepharose 4B亲和层析.经纯化的番薯过氧化物酶比活力为6 930 U/mg,SDS-PAGE显示一条带,分子量为34 000,RZ值为2.酶反应的最适pH在5.5附近,最适温度为70℃;在中性偏碱性条件下酶的稳定性非常高,60℃保温1 h,酶活力残余60%.结果表明番薯过氧化物酶是一种良好的耐酸碱、耐热过氧化物酶.     

产结晶纤维素酶的嗜热菌鉴定及其酶学性质

从云南腾冲热海温泉采集的样品中,分离出一株产结晶纤维素酶的嗜热菌TC-1.该菌株呈杆状,革兰氏阴性,生理生化特征分析和16S rDNA序列同源性比对表明它属于亚栖热菌属Meiothermus.结晶纤维素、木聚糖和葡萄糖可以诱导该菌产生结晶纤维素酶,其中结晶纤维素诱导的酶活力最高.对其产生的结晶纤维素酶进行了初步纯化与酶学性质研究,该酶的最适反应温度为70℃,最适pH为6.0,在50℃～70℃和pH5.5～6.5之间酶活力相对稳定.     

产热稳定α-半乳糖苷酶菌株的筛选及酶活力的初步研究

利用选择性培养基从发霉的豆粕、豆油工厂周围环境中取样并分离纯化获得一株产热稳定性α-半乳糖苷酶耐热真菌,通过形态学和分子生物学鉴定方法初步鉴定该菌株为分枝犁头霉.研究表明该菌株生长的最适温度和pH值是47℃和7.0,所产酶为胞内酶.酶活研究表明粗酶液的最适温度和pH值分别为68℃和7.0,具有较好的热稳定性.     

静电纺PA6/PVA纳米纤维及其纤维素酶的固定研究

利用静电纺丝技术制备PA6/PVA纳米纤维.通过环氧氯丙烷法活化羟基,将纤维素酶固定于PA6/PVA纳米纤维上.考察固定化纤维素酶和自由纤维素酶的酶活,研究固定化纤维素酶的酶学性质.结果表明:自由酶的最适反应温度为55℃,而固定化酶的最适反应温度为65℃,比自由酶的提高了10℃;与自由酶相比,固定化酶的活性随pH值的变化曲线明显变宽,热稳定性显著增强;固定化纤维素酶在4℃下能长时间保持较高的活力.     

从黑曲霉发酵粉中分离纯化一种内切β-葡聚糖苷酶

通过硫酸铵分级沉淀 ,CM -SephadexC - 2 5 ,DEAE -SephadexA - 5 0 ,POROS 2 0HQ离子交换色谱分离方法 ,从黑曲霉发酵粉中分离纯化了一种新的内切 β -葡聚糖苷酶 .该酶在还原条件下分子量为 39.2kD ,最适pH为 4.0 ,最适温度为 5 5℃ ,Km 为 7.41mg mL .     

枯草芽孢杆菌葡聚糖内切酶的克隆与表征

利用已公布的枯草芽孢杆菌基因组序列中假定的葡聚糖内切酶基因进行引物设计,从菌株Bacillus sp.ECU0013中克隆表达得到重组葡聚糖内切酶BsEG.经镍柱纯化后进行酶学性质表征,其最造反应pH约为6.0;最适反应温度为50℃,具有较好的热稳定性,50℃时半衰期达101h.Km值为20.1 g/L,相应的Vmax...     

重组毕赤酵母产匍枝根霉内切葡聚糖酶Ⅱ的分离纯化及其酶学性质研究

将来源于匍枝根霉的endoglucanase Ⅱ(egⅡ)在毕赤酵母中实现异源表达,对构建完成的重组毕赤酵母进行高密度发酵,制备目标酶蛋白．发酵液经 Ni 柱分离纯化,得到分子量大小约为38 kDa,比酶活为37．8 IU/mg的蛋白．酶学性质研究表明：该酶最适反应温度为55℃,最适反应 pH 为4．8;Mn2＋、Zn2＋、Fe2＋对egⅡ的酶活力有一定的激活作用,Cu2＋对egⅡ酶活有抑制作用,Mg2＋、Co2＋、Na＋和K＋等离子对该酶的催化活力没有明显影响;该酶以CMC-Na为底物时其反应米氏常数为2．04 mg/ml．