检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法的建立及初步应用

鹅细小病毒(GPV)是一种主要侵害雏鹅和雏番鸭的病原,给养禽业带来了巨大的经济损失.利用GPV的VP3基因保守区域设计了一对引物和探针,经反应体系的优化,建立检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法(ii PCR方法),并与TaqMan荧光定量PCR方法比较.结果显示,该方法能特异性检出GPV,对其他常见无关病原不检出,特异性好;检测下限是38.1拷贝·μL^-1,灵敏度高;批内、批间变异系数均小于5%,重复性好;该方法对31份临床疑似样本的检出率为93.54%,高于TaqMan荧光定量PCR方法的检出率(83.87%).本研究为鹅细小病毒的现场快速检测提供了新的技术手段.     

雏番鸭细小病毒疫苗在雏番鸭、雏鸡体内诱导的免疫动态研究

用雏番鸭细小病毒(Muscovy Ducklling Parvovirus MPV)灭活疫苗对不同日龄的雏番鸭作首免,以及用MPV不同剂型的疫苗对同样日龄的雏番鸭作免疫试验,在免疫前及免疫后多次采血,用酸性o—醋酸菜酯酶(ANAE)反应标记淋巴细胞的细胞化学方法及琼脂扩散试验等分别测定其外周血液中T.B淋巴细胞百分比值和MPV沉淀抗体滴度,首次探索MPv在雏番鸭体内诱导的免疫动态,为本病的免疫防制提供了可行的免疫程序和理论依据.试验同时设立雏鸡免疫对照,探索了非易感动物对MPV免疫的应答差异和应用鸡作免疫载体制备MPV高免血清的可行性.     

O型口蹄疫病毒VP4蛋白一个保守性表位的精细鉴定

口蹄疫病毒(FMDV)的结构蛋白VP4在7个血清型之间是非常保守的,对其抗原表位最小基序的测定有助于开发广谱性多肽疫苗.本研究采用生物合成肽法,利用豚鼠抗FMDV O型标准血清,对最新流行的FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的VP4蛋白进行了线性表位扫描作图研究.结果表明:在覆盖VP4蛋白全长序列的10个18聚肽中,发现1个能与豚鼠抗FMDV O型标准血清发生免疫印迹反应的抗原性肽VP4-3;B细胞表位鉴定确定了抗体识别VP4-3的最小基序是INNYYM;该表位位于VP4蛋白的三维结构表面;对7个FMDV血清型的122个毒株同源蛋白质进行序列比对,发现这一表位在7个FMDV血清型的120个毒株中是100%保守.     

高免蛋黄抗体中和雏鸭肝炎病毒(DHV)的效价测定

用鸭胚测定半数致死量并进行中和试验，测定了用雏鸭肝炎病毒(Ⅰ型)免疫蛋鸭收获的鸭蛋所制成的蛋黄抗体的滴度．结果表明，雏鸭肝炎病毒(Ⅰ型)的半数致死量为3．50，该毒株的高免蛋黄抗体以1：532稀释可保护50％的鸭胚免于死亡；病毒对照组全部死亡；空白对照组全部存活．该雏鸭病毒性肝炎高免蛋黄抗体滴度较高，可用于预防和治疗雏鸭病毒性肝炎。     

PRRSV福建流行毒株结构蛋白基因之克隆分析

对福建省流行的PRRS病毒FJ-1的结构蛋白基因进行了克隆、测序.FJ-1结构蛋白基因序列长3 188个核苷酸,包含7个开放阅读框(ORF).将FJ-1结构蛋白基因与国内外已发表的18个报道全长结构蛋白基因的PRRSV毒株进行核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较,发现:其与17个美洲型毒株核苷酸同源性达到89.7%～92.4%,推定各个ORF编码氨基酸的同源性在85.6%～98.6%之间;而与欧洲型毒株Lelystad核苷酸同源性为54.9%,推定各个ORF编码氨基酸同源性为53.2%～78.2%.遗传进化树分析表明FJ-1与美洲型毒株进化距离近,而与欧洲型毒株进化距离远.从分子水平上证明了福建省流行的PRRS病毒属于美洲型毒株.     

猪繁殖和呼吸综合征病毒福建毒株ORF5的序列分析及原核表达

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(p1/p2),用RT-PCR扩增PRRSV福建毒株FJ-1的全长糖基化囊膜蛋白基因(ORF5),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一条引物(p3)与p2从重组载体pUCm-T-ORF5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入表达载体pGEX-4T-3后在大肠杆菌中表达.结果表明,FJ-1毒株ORF5基因为603 bp,编码200个氨基酸,与北美型参考毒株VR-2332、CH-1a及欧洲型参考毒株LV的氨基酸同源性分别为87%、89%和53%,推定福建毒株FJ-1属于北美型毒株.原核表达产物经过SDS-PAGE及Western Blot分析,证实为GP5与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白.分子量为41 kDa.表达量约占菌体蛋白的15%,主要以包涵体形式存在.     

猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1a株结构蛋白基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR方法克隆了我国首次分离的PRRS病毒CH-1a株的6种结构蛋白基因(ORF2～7),并进行了核苷酸序列测定．利用序列分析软件分析了各基因编码产物的分子量、等电点、疏水性、抗原性和糖基化位点等,并与欧美毒株进行了比较,绘制了其系统发育进化树．结果显示cH-1a株与流行于北美洲的PRRS病毒株遗传关系很近,而与欧洲的病毒株遗传关系较远,表明流行于我国的PRRS病毒可能来自北美洲。     

1 型鸭肝炎病毒强毒株在雏鸭体内分布情况研究

摘要: 目的 利用建立的 Taq 荧光定量 ＲT-PCＲ 检测方法研究鸭肝炎病毒( DHV-1) 强毒株在感染雏鸭体内早期的动态分布规律。方法 本研究采用鸭肝炎病毒强毒株人工感染 3 日龄雏鸭,利用已建立的 Taq 荧光定量 ＲT-PCＲ方法,对接种 24 h 内 DHV-1 强毒株感染雏鸭的组织脏器进行了定量检测。结果 接种后 4 h 即可在雏鸭心、肝、脑、肺、胰腺、回肠、盲肠、直肠、法氏囊和脾脏组织中检测到一定水平的病毒 ＲNA,随着病程发展,ＲNA 拷贝数持续升高,接种 24 h 后,肝脏中的病毒 ＲNA 拷贝数为最高,达到 108. 81 copies/g,心、肺、肾、脾次之,约 107copies /g。结论DHV-1 强毒在雏鸭的早期感染雏鸭的实质器官、免疫器官和消化系统等均具有广泛的嗜性。     

多个发夹RNA的混合使用抑制O型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒的复制

通过对国内流行的口蹄疫病毒(FMDV)毒株的序列分析,锁定RNA干扰的3个目标基因即3D,VP4和2B, 分别编码聚合酶POL,病毒结构蛋白VP4和非结构蛋白2B,这3个靶基因序列在不同流行毒株之间相对保守.分别设计合成靶向这些基因序列的发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA)表达模板,构建了5个shRNA表达质粒p3D-NT56,p3D-NT19,pVP4-NT65,pVP4-NT19和p2B-NT25.进行单独应用或混合应用,于细胞水平和乳鼠水平检测其抗病毒活性.结果显示,3D-NT56/19,VP4-NT65/19和2B-NT25 shRNA对O型FMDV均有抑制作用,但是对AsiaⅠ型FMDV,仅2B-NT25 shRNA具有较显著的抑制作用.3个shRNA表达质粒的混合使用(p3D-NT56+pVP4-NT65+p2B-NT25,p3D-NT19+pVP4-NT19+p2B-NT25),不仅能够交叉抑制不同血清型FMDV的复制,而且这种抑制作用较单一shRNA延续更长的时间.     

雏番鸭细小病毒人工感染雏鸡体内带毒时间的测定

应用雏番鸭细小病毒(Muscovy Ducklling Parvovirus.MPV)南海里水株番鸭胚传代病毒人工感染7日龄石歧杂雏鸡,每只用本病毒原液经颈部皮下、口服及滴鼻共接种1.5ml/只.接种病毒的雏鸡隔离饲养,注意观察有无异常症状,并分别于接种后24小时、72小时、7天、14天、28天各随机迫杀5只雏鸡,每次迫杀鸡只收集心、肝、脾、肾、脑无菌处理成1:10悬浊液,反复冻融5～6次,3000rpm15分钟,离心取上清液速冻保存.所获无菌上清液分别在11天龄健康番鸭胚连传3代.每个样品重复1次.收集传代胚液作病毒鉴定.结果应用MPV人工感染雏鸡,不见任阿异常症状.于接种后24小时、72小时、7天追杀者可重复分离到本病毒,人工感染14天后,不能复分离病毒.复分离病毒经中和试验,琼脂扩散试验和电镜观察可确认为MPV.试验结果表明,雏鸡属于本病的非易感动物,但人工大剂量接种MPV,体内带毒时间最少可持续7天.     

蜜蜂囊状幼虫病毒多聚蛋白基因遗传结构分析

为了解蜜蜂囊状幼虫病毒的遗传变异及分化,采用多聚蛋白基因对其进行遗传结构分析.结果表明:在比对的441bp基因片段中,有356个保守位点,85个变异位点,无缺失位点.构建系统进化树显示该病毒存在3个明显的分支,分支Ⅰ为中国的重庆、云南病毒株;分支Ⅱ为印度病毒株;分支Ⅲ为德国、英国、奥地利、韩国病毒株.中国、韩国、尼泊尔、印度等亚洲地区存在多个病毒株.中介网络图显示病毒株基本按照宿主种类进行聚类,表明同一地区存在多个病毒株系可能与宿主有密切关系.     

大连湾牡蛎蛋白的分离提取及分子量测定

以大连湾牡蛎为实验材料．首先采用冰醋酸粗提法提取牡蛎蛋白,然后用葡聚糖凝胶(Sephadex-G100)进行柱层析分离,SDS—聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白,Kodak凝胶成像分析仪分析及测定分子量．结果显示大连湾牡蛎中含有分子量为55kd的牡蛎特征蛋门,同时分离出其它4种蛋白质,分子量介于33．0～63.4kd之间．     

野荆芥化学成分研究

从野荆芥(CaryopteristernifloraMaxim.)全草的乙醇提取物中分离出9种化合物,经波谱分析和理化常数测定确定其结构为软酯酸 1 甘油脂(1),齐墩果酸(2),acacetin 7 rutinoside(3),agnu side(4),β 谷甾醇(5),豆甾醇(6),胡萝卜甙(7),三十二烷醇(8)和三十四烷酸(9),其中1～4为首次从本属植物中分离得到     

昆虫内生真菌Alternaria sp.次级代谢产物研究

利用正相和反相柱色谱,Sephadex LH-20凝胶柱色谱及反相HPLC等方法从昆虫内生真菌Alternariasp.(Be-1)的发酵液中分离得到4个混源萜类化合物,经NMR,MS及理化性质等方法,结构确定为Tricycloalternarene 2a(1),Tricycloalternarene 2b(2),Tricycloalternarene 3a(3),Tricycloalternarene F(4).测定了化合物1-4对受体酪氨酸激酶的抑制活性,测试结果表明,化合物3和4对三种酪氨酸激酶的抑制活性较强.     

多个发夹RNA的混合使用抑制O型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒的复制

通过对国内流行的口蹄疫病毒(FMDV)毒株的序列分析,锁定RNA干扰的3个目标基因即3D,VP4和2B,分别编码聚合酶POL,病毒结构蛋白VP4和非结构蛋白2B,这3个靶基因序列在不同流行毒株之间相对保守.分别设计合成靶向这些基因序列的发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA)表达模板,构建了5个shRNA表达质粒p3D-NT56,p3D-NT19,pVP4-NT65,pVP4-NT19和2B-NT25.进行单独应用或混合应用,于细胞水平和乳鼠水平检测其抗病毒活性.结果显示,3D-NT56/19,VP4-NT65/19和2B-NT25shRNA对O型FMDV均有抑制作用,但是对AsiaⅠ型FMDV,仅2B-NT25shRNA具有较显著的抑制作用.3个shRNA表达质粒(p3D-NT56 pVP4-NT65 p2B-NT25,p3D-NT19 pVP4-NT19 p2B-NT25)的混合使用,不仅能够交叉抑制不同血清型FMDV的复制,而且这种抑制作用较单一shRNA延续更长的时间.     

马铃薯卷叶病毒陕西分离物外壳蛋白(CP)的生物信息学分析

目的分析预测马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白的理化性质及结构。方法应用DNA-MAN软件、ExPASy中的ProtParam工具,SignalP,LipoP程序,TMHMM,PSIPRED和3D-PSSM等方法,分析PLRV.CP的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、亲疏水性、可溶性、信号肽、跨膜结构域、二级结构、保守区域、三级结构等。结果陕西PLRV.CP,与已报道的PLRV.CP高度同源。蛋白序列分析显示无跨膜螺旋结构,不属分泌蛋白,是可溶的亲水性蛋白。二级结构主要为折叠和无规则卷曲,不含转角。三级结构保守区预测表明,该蛋白属于黄化病毒属外壳蛋白成员。结论对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白的生物信息学分析为进一步研究其功能、探索抗病途径奠定了基础。     

白斑综合症病毒对对虾Caspase基因的调控

研究病毒感染对白斑综合症病毒基因的录调控的影响,将Caspase调控区的DNA进行生物素标记,然后与链霉亲和素修饰的琼脂糖结合.通过下拉发现,Caspase基因的启动子序列与white spot syndromic virus(WSSV)病毒的两个蛋白Vp38和Vp41B有相互作用.通过荧光素酶报告基因发现,Vp38和Vp41B对Caspase启动子活性分别有抑制和激活作用.采用RNAi技术下调两个WSSV蛋白的表达后,研究发现:Vp38和Vp41B分别对对虾血细胞的凋亡水平有促进和抑制的调控作用.     

网上垫料养殖模式对番鸭养殖粪污及空气质量的影响

为研究网上铺设锯末和稻壳养殖番鸭对粪污及栏舍内空气质量的影响,试验选取14日龄公番鸭180只,随机分为2组,对照组为番鸭直接在网上进行养殖,粪污通过网眼排到地面,试验组番鸭则是在铺设锯末和稻壳后的网上进行养殖,每周对栏舍内NH3和CO2浓度进行测定,70日龄养殖结束后收集所有粪污进行测定.结果显示,与对照组相比,试验组可达到污水零排放,显著降低粪污的含水率(P<0.01),显著减少粪污排放量(P<0.01),并显著提高垫料和鸭粪混合形成的粪污总氮含量(P<0.01)及pH值(P<0.01),提高粪污中有机质含量(P>0.05);与对照组相比,试验组栏舍内NH3浓度没有显著差异,而CO2浓度有显著提高(P<0.05).因而,网上铺设锯末和稻壳养殖番鸭可减少粪污的排放.     

SARS-CoV棘突蛋白片段在E.coli中的表达及免疫活性分析

SARS-冠状病毒(SARS-CoV)棘突蛋白(Spike,S)是构成病毒包膜突起的主要成分,属于型膜糖蛋白,全长1255aa,在病毒入侵宿主细胞中起重要作用.本文利用生物信息学技术,界定冠状病毒SARS-CoVS蛋白的抗原决定区域,通过PCR扩增相应片段,克隆至原核表达载体pET-H,得到四个重组质粒pET-HS1、pET-HS3、pET-HS4、pET-HS5.经序列测定证实后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导获得表达,产物经紫外薄层扫描显示目的蛋白占菌体细胞总蛋白量的20%~30%.经Westernblot检测,表达蛋白与恢复期SARS病人血清呈高反应原性.纯化相应蛋白免疫小鼠,所获抗血清效价达1∶3×103.与SARS诊断试剂反应呈阳性,这一工作将为进一步研究S蛋白的定位、功能及SARS诊断提供帮助.     

白鲜皮的化学成分研究

研究白鲜Dictamnus dasycarpus干燥根皮的化学成分.对白鲜皮的乙酸乙酯萃取组份进行分离.利用正相硅胶柱色谱、ODS柱色谱、重结晶法以及HPLC(制备型)法进行分离纯化,通过理化常数测定和波谱技术鉴定化合物的结构.分离得到5个化合物,分别鉴定为绿原酸(1),紫丁香苷(2),双氢松柏醇(3),4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(4),豆甾醇(5).其中,化合物(1)和(2)为首次从该属植物中得到.