三角梅SRAP-PCR反应体系的建立及引物筛选

利用L9(34)正交试验设计,对影响PCR反应的TaqDNA聚合酶量、dNTP浓度、Mg2+浓度和引物浓度4个因素以及模板DNA浓度进行了三角梅SRAP-PCR扩增反应条件优化研究,并对引物进行了全面筛选.三角梅SRAP-PCR优化反应体系结果为:2.5μL 10×PCR buffer、60ng模板DNA、TaqDNA聚合酶1.0U、dNTP 0.25mmol/L、Mg2+2.5mmol/L、引物0.3μmol/L,总体积25μL.运用该结果从208对引物组合中共筛选出扩增条带清晰,多态性丰富的SRAP引物27对.优化体系的建立及其引物的筛选为今后利用SRAP标记技术进行三角梅遗传分析、图谱构建、基因定位与种质资源鉴定奠定了技术基础.     

怀地黄HPLC指纹图谱研究

目的:建立并比较怀地黄不同栽培品种HPLC指纹图谱,为强化怀地黄质量控制和品种鉴定与划分建立图谱标准.方法:采用HPLC,以0.4%醋酸溶液和乙腈进行梯度洗脱,检测波长为260nm;柱温:30℃;流速:1mL/min.使用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统"进行数据处理,对不同栽培品种怀地黄的HPLC指纹图谱进行了相似度和聚类分析.结果:获得了HPLC优化技术条件;建立了含有18个特征指纹峰的怀地黄HPLC化学对照指纹图谱;9个农家品种划分为2大类,又可细分为4类.结论:该图谱可作为怀地黄质量控制的标准图谱,为怀地黄的质量控制、品种鉴别及划分提供理论和技术支撑.     

梨ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

以‘饼子梨’为试材,利用正交设计L16(45)研究了反应体系中引物、模板DNA浓度等5个因素4个水平对梨反应体系的影响,PCR结果应用极差分析和MINITAB软件对扩增结果进行方差分析.梨最佳ISSR-PCR反应体系:25μL反应体系中含2.5μL 10×Buffer,2.0mmol/L Mg2+,0.25mmol/L dNTPs,0.25μmol/L引物,60ng模板DNA,0.75UTaq DNA聚合酶.优化的ISSR-PCR反应体系稳定性高和重复性较好,为梨品种指纹图谱构建和遗传多样性分析奠定基础.     

利用正交设计优化一品红SRAP反应体系

运用L16（4^5）正交设计对影响一品红SRAP反应的5个因素（DNA模板浓度、M矿’浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶）在4个水平上进行优化试验,PCR结果采用DPSV3．01软件分析。结果表明,各因素对SRAP反应的影响依次为：Mg2＋〉引物〉dNTPs〉DNA模板〉Taq酶;一品红SRAP反应最佳体系为：50μL的PCR体系中含有Mg2＋ 2．5mmol·L-1．引物500pmol·L-IdNTPs 0．20mmol·L-1．DNA模板100ng、Taq酶1．0U;应用最佳反应体系对PCR程序中的退火温度进行优化,得出SRAP—PCR反应适宜的第一步退火温度为36℃,第二步退火温度为50℃。     

柳树RAPD反应体系均匀设计试验研究

从柳树幼苗的嫩叶中提取基因组DNA作为模板,运用均匀设计方法,获得;柳树RAPD扩增反应的优化体系：25μL反应体系中,DNA模板用量70 ng,引物浓度0.5mmol.L-1,Mg2＋浓度3mmol.L-1,TaqDNA聚合酶用量1.0 U,dNTP浓度0.3mmol.L-1.用16条引物进行验证,证实该体系重复性好、结果稳定.     

地石榴ISSR扩增体系优化及应用

以地石榴为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子,如引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、模板DNA浓度、退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合地石榴的IS-SR-PCR反应体系:20μL体系中,10×buffer 2.0μL,引物0.50μmol.L-1,dNTPs 0.15 mmol.L-1,Mg2+1.2mmol.L-1,Taq DNA酶1.25 U,模板DNA 25 ng.确定了适宜的退火温度为52℃.利用该优化后的体系从60条ISSR引物中筛选出了12条,随机选取2条对10份分布于不同地区的地石榴标本基因组DNA进行扩增,证实了该体系稳定可靠,可用于进一步分析地石榴居群遗传多样性.     

濒危植物长柄双花木ISSR-PCR反应体系的优化

采用改进的CTAB法提取长柄双花木(Disanthus cercidifoliusvar.longipes)基因组DNA,并以此DNA为模板,对ISSR-PCR的反应体系进行了优化,建立了适合长柄双花木ISSR-PCR的反应体系和程序,即20μL的反应体系中,含模板DNA20 ng,Mg2+2.0 mmol.L-1,引物0.25μmol.L-1,dNTPs 0.20 mmol.L-1,TaqDNA聚合酶1.0 U;扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,48~54℃复性45 s;72℃延伸90 s;共36个循环;循环结束后,72℃延伸7 min.本研究为利用这一分子标记对长柄双花木进行遗传多样性分析奠定了基础.     

山药基因组DNA的提取和RAPD反应条件的优化

研究了山药基因组DNA的提取方法;对Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量进行了优化,建立了最佳的RAPD反应体系:在25μL反应体系中Mg2+浓度为2.0 mmol.L-1,dNTPs浓度为0.25 mmol.L-1,引物浓度为20 pmol.L-1,Taq酶1.5 U,模板DNA为200 ng.扩增程序为:95℃预变性7 min;94℃变性30 s,36℃退火45 s,72℃延伸2 min,共35个循环;72℃终延伸10 min.     

太行菊SRAP-PCR反应体系的建立与优化

相关序列扩增多态性（SRAP）是一种新发展起来的分子标记技术,在太行菊中还未见相关的报道。为建立优化适合太行菊SRAP分析的扩增体系,以太行菊DNA为模板,对影响SRAP-PCR反应体系的5个重要参数设置梯度进行单因素实验分析,以确定最佳的反应条件。经过大量的重复性实验确定了适合太行菊SRPA-PCR反应体系：20μL的反应体系中,模板DNA量50ng,1.25mmol/L的Mg2＋浓度,0.5μmol/L的上下游引物,0.2mmol/L的dNTPs以及Taq酶1U。该体系在太行菊个体中均能扩增出清晰稳定的条带,为后续的太行菊遗传多样性分析奠定了基础。     

均匀设计优化黑木相思ISSR-PCR体系

采用均匀设计,对影响黑木相思ISSR-PCR体系的引物、Mg2 、dNTP、Taq DNA聚合酶和模板DNA浓度等进行5因素5水平和5因素3水平两轮优化,建立了适合于黑木相思ISSR-PCR的体系:在20μL反应体系中,含引物0.30μmol.L-1,Mg2 3.00 mmol.L-1,dNTP 0.15 mmol.L-1,Taq DNA聚合酶0.75U,模板DNA 2.00 ng.μL-1.在此基础上对扩增程序中的循环次数、退火温度、退火时间进行筛选,获得的扩增程序为:94℃预变性5 min;接着进行33个循环:94℃变性35 s,52~61.5℃退火52 s,72℃延伸90 s;循环结束后,72℃延伸10 min.同时筛选得到10个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.     

怀地黄85-5叶片愈伤组织快速诱导和植株再生的研究

以怀地黄85-5无菌苗的叶片为外植体,接种到含有不同浓度植物生长物质的MS培养基上,可诱导愈伤组织,进而可分化出芽和根,从而实现了由叶片到完整植株的快速繁殖.本实验着重研究了不同浓度的6-BA对怀地黄叶片愈伤组织芽的分化的影响,及在何种浓度诱导愈伤组织和芽的分化时间最短.结果表明培养基中加入1.0 mg.L-1的6-BA最有利于怀地黄愈伤组织芽的分化,同时,在该浓度芽的分化所需时间最短.这种经快速诱导形成的不定芽经生根培养后可进行移栽,移栽后成活率可达90%.     

发根农杆菌T-DNA诱变怀地黄突变体或品系的遗传学分析

主要采用紫外吸收光谱法、高效液相色谱法、3,5-二硝基水杨酸比色法,PCR和SRAP技术,从叶绿素含量、还原糖和总糖含量、梓醇含量、毛蕊花糖苷含量和T-DNA片段的稳定性和基因组DNA的变化方面,对发根农杆菌转化怀地黄突变体或品系的变异性状进行了分析.发现怀地黄突变体或品系的叶片形态、植高、叶绿素含量、糖含量、梓醇和毛蕊花糖苷的含量均有变异,一个SRAP引物组合从其基因组DNA中扩增出一个对照中没有的约400bp的DNA片段,T1-T7代突变体或品系中均检测到rolB基因的存在.这些结果表明发根农杆菌T-DNA可以诱导怀地黄产生变异,并且稳定遗传.     

怀地黄试管苗脱毒技术研究

对怀地黄试管苗的脱毒技术进行了研究.结果发现:以MS为基本培养基并附加适宜浓度细胞分裂素(6-BA0.5 mg.L-1或KT0.5 mg.L-1)时,茎尖成苗率最高(75%),出愈率较低(20%);切离的茎尖大小为0.2~0.5 mm时,既能保证较高的脱毒率又可保证较高的成苗率;两次切离茎尖并与热处理相结合,试管苗的脱毒率最高(96%~100%),建立了一种有效的怀地黄脱毒方法和技术.     

油茶SRAP-PCR反应体系的建立

以油茶品种大别山2号和赣兴46为试验材料,利用Me5Em8正反向引物组合进行了SRAP-PCR反应体系的L9(34)正交试验,采用正交设计直观分析及方差分析对影响SRAP反应的Taq聚合酶、Mg2+、dNTP和引物浓度进行分析,并对模板DNA浓度进行了单因素试验分析。结果表明,油茶SRAP-PCR 20 μL反应体系的最佳组合为: Taq聚合酶1.20 μmol/min、Mg2+浓度125 mmol/L、dNTP浓度0.15 mmol/L、Primer浓度0.60 μmol/L、模板DNA含量60 ng,并含有2 μL 10×buffer(Mg2+ free)。各因素对油茶SRAP-PCR反应的影响大小依次为:dNTP、 Mg2+ 、Taq聚合酶、Primer。     

杉木SRAP-PCR体系优化

为建立杉木SRAP-PCR反应体系,利用L₁₆(4⁵)正交设计对影响杉木SRAP-PCR反应体系的Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq酶和DNA浓度5种因素的4个水平进行优化实验,结合正交直观分析和方差分析,对影响反应较大的Mg²⁺、dNTPs和引物浓度进行单因素实验,最终确定杉木SRAP-PCR最佳的反应体系为:在20 μL的PCR反应体系中,Mg²⁺浓度为2.25 mmol/L、dNTPs为0.15 mmol/L、引物浓度为0.4 μmol/L、Taq酶为1.5 μmol/min、模板DNA为60 ng,10×PCR Buffer 2 μL,不足部分用双蒸水补充至20 μL。PCR反应程序的两步最适退火温度第1步为35 ℃,第2步为53 ℃。利用上述反应体系进行杉木PCR扩增,能得到清晰、稳定的条带。     

怀地黄不同品种花粉形态的扫描电镜观察

利用扫描电镜观察了14个品种怀地黄[Rehmannia glutinosa f.hueichingens-is(Chan et Sehih)Hsiao]的花粉形态.结果表明:花粉均为单粒花粉,呈长圆形至长矩圆形,大小为40.2~46.9μm,具3个萌发孔,网状纹饰,网眼明显;根据花粉形状可将其分为3类:(1)长方形或近长方形(2)椭圆形或近椭圆形(3)梭形.研究表明,花粉特征,特别是花粉的形态特征,在怀地黄不同品种间具有的可见变异,它们在分类学上的价值应予以关注.     

怀区熟地傅里叶变换中红外光谱指纹图谱研究

目的:建立怀区熟地的中红外指纹图谱.方法:利用傅立叶变换中红外光谱技术结合对比分析软件对不同炮制方法、炮制时间的10个熟地样品的红外光谱进行测定分析.结果:(1)建立了怀区熟地指纹图谱,得到13个共有特征峰;(2)不同熟地指纹谱相似度较好,说明怀区大多数熟地样品的组分、质量相近;(3)聚类分析结果表明,除9号、10号聚为一类,其他相同方法炮制的均聚为一类,可能是因为9号炮制时间为2012年,对熟地质量有影响.说明炮制方法、贮存时间对熟地品质有影响.结论:为鉴别不同炮制方法的熟地提供了一种简单、快捷、有效的手段,为地黄的深加工质量控制提供技术支撑.