禽流感病毒H7亚型快速检测方法建立及应用

通过杂交瘤技术及单克隆抗体技术获得针对禽流感病毒H7亚型的特异性单克隆抗体.抗体用于标记荧光微球,并基于双抗体夹心免疫层析法用于对禽流感病毒H7亚型的检测.针对禽流感病毒H7亚型,检出限为0.125 HAU,具有较高的灵敏度,所建立的禽流感病毒H7亚型荧光检测试纸具有良好的特异性和准确性,可用于对禽流感病毒H7亚型的现场快速检测.     

病毒样颗粒为阳性对照的H5N1实时荧光定量PCR检测方法的建立

合适的标准品对实时荧光定量PCR(qPCR)检测高致病性H5N1禽流感病毒(avain influenza virus,AIV)十分重要.本研究将H5N1AIV HA基因的部分序列插入到能够表达MS2噬菌体病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)DNA序列的表达载体上,诱导表达后得到了包裹有H5N1AIV HA基因RNA片段的VLP.该VLP能够耐受核酶的消化,形态与MS2噬菌体病毒颗粒形态相同.利用表达的VLP作为阳性标准品及设计的特异性荧光探针、淬灭链,使用优化的qPCR反应体系,得到qPCR检测H5N1亚型AIV的阳性对照标准曲线.研究结果为高致病性H5N1亚型AIV的准确定量检测提供了基础.     

高致病性禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断高致病性禽流感,根据H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,利用这两对引物对H 5,H 7亚型禽流感病毒的HA基因片断进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这两对引物能特异性地扩增出H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490 bp和375 bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H 5,H 7亚型高致病性禽流感病毒的分子诊断方法。     

禽流感病毒H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的研究

 在获得禽流感病毒多克隆抗体及H5亚型特异性单克隆抗体的基础上,研究建立H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5亚型禽流感病毒.优化反应条件,确定包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与RT-PCR方法比较.同时使用该方法对野外样品进行检测.结果表明:该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H5亚型禽流感病毒.     

禽流感病毒H9亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的研究

 采用禽流感病毒多克隆抗体及H9亚型特异性单克隆抗体,研究建立H9亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H9亚型禽流感病毒.优化了反应条件,确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与RT-PCR方法比较.通过使用该方法对野外样品进行检测.结果表明该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H9亚型禽流感病毒.     

实验室病毒检测能力验证与粪便样本中小鼠诺如病毒的检测

目的 通过对国际实验动物科学理事会(the International Council for Laboratory Animal Science, ICLAS)能力验证计划(Performance Evaluation Program, PEP)提供的4份病毒盲样进行检测,从而对实验室病毒检测能力进行验证,进一步提高实验室的病毒检测水平。方法 对ICLAS提供的盲样信息进行分析,提取核酸进行PCR检测并对阳性产物进行测序验证。对诺如病毒阴性盲肠内容物进行不同倍数的稀释后,与诺如病毒培养液1∶1混合,使用两种不同的核酸提取试剂盒进行核酸提取,通过荧光定量PCR方法进行诺如病毒核酸检测,比较检测的核酸拷贝数。结果 经过检测确定ICLAS提供的盲样分别为小鼠脑脊髓炎病毒、小鼠诺如病毒、小鼠轮状病毒以及小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒。比较不同稀释度的盲肠内容物诺如病毒荧光定量PCR检测结果发现,使用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取核酸,稀释度不高于1∶16时,检测结果相比于病毒对照出现不同程度的偏差,稀释度为1∶32时检测结果与病毒对照检测结果相近。使用病毒RNA提取试剂盒提取核酸,稀释度不低于1...     

非结构蛋白NS1-ELISA检测禽流感野毒感染抗体

利用RT-PCR技术扩增获得了H5N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为678 bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1 mmol／I的IPTG诱导表达5 h,经15％的SDS-PAGE分析表明,诱导表达出了分子量大约为28 KD的 NS1融合蛋白,且以包涵体的形式存在,NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化或用尿素变性复性,获得纯度较高的NS1蛋白,并以此为抗原,建立了检测抗NS1蛋白抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法。最佳包被浓度为2．5μg／ml,血清的最佳稀释倍数为1:200, 酶标二抗的最佳工作稀释度为1:5 000。重组NS1蛋白只与AIV感染的血清反应,而不与ND、IB、IBD、EDS76的阳性血清反应。分别检测H9N2、H5N2和H5N1亚型灭活疫苗和H9N2纯化病毒免疫的血清,各5份,其平均OD490值分别为0．225、0．210、0．205和0．184．均为阴性;而对H9N2和H5N2亚型活毒感染10-15 d的血清进行检测,各5份,其平均OD490值分别为0．610和0．619,均为阳性。因此,NS1蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群,可作为一种鉴别诊断标记,但不能区分亚型．具有A型特异性。NS1-ELISA 方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。     

抗甲型流感病毒H1N1亚型单克隆抗体制备及应用

采用快速免疫佐剂免疫小鼠,通过杂交瘤技术获得针对甲型流感病毒H1N1亚型的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株.共获得7株能稳定分泌特异性抗体的细胞株,经腹水诱生和Protein A亲和层析纯化的抗体用于标记荧光量子点,并基于双抗体夹心免疫层析检测用于对甲型流感病毒H1N1亚型的检测.针对甲型流感病毒H1N1亚型,检出限为3.06×10~3TCID_(50)/L,具有较高的灵敏度,所制备的抗体在检测中具有良好的特异性和准确性,可用于对甲型流感病毒H1N1亚型的现场快速检测.     

HPV分型及其定量检测在黑龙江东部地区宫颈病变中的临床意义

研究黑龙江东部地区宫颈疾病中HPV亚型分布及与患者感染量的关系,为临床提供参考。对本地区2011～2017年就诊的500位宫颈疾病患者,运用液基细胞学技术与人乳头瘤病毒核酸分型试剂盒对宫颈脱落细胞进行检测,采用实时荧光定量PCR技术检测HPV不同亚型的量。HPV阳性检出率为71.0%,检出HPV的4种高危亚型。结合液基细胞学技术检验,病变越严重,HPV亚型感染量越高。在本次检测中,HPV16亚型的检出率最高。感染量越多,患者病变程度越高。临床可将病毒载量作为判断病变程度的辅助指标。     

这个春天,我们预防禽流感

流感病毒是流行性感冒病毒的简称，在分类上流感病毒属正粘病毒科，包括甲、乙、丙(也称A、B、C)3个型别。流感病毒可引发人类、禽类和动物类的“流行性感冒”，其中禽流感病毒是甲型流感病毒中的某些亚型(如H2N1、H9N2、H7N7等)。它们以鸡、鸭等禽类病毒贮存，宿主可以感染人类，早年已有若干先例。而此次出现的禽流感病毒主要为甲型流感病毒中的H5N1亚型。     

鸡禽流感母源抗体的消长规律及其免疫效果研究

为探讨科学的鸡禽流感免疫程序,对1～28日龄的土杂肉鸡和罗曼蛋鸡进行禽流感母源抗体检测,以及对雏鸡接种禽流感油乳剂疫苗后的HI抗体水平变化进行了监测。结果表明,两种雏鸡的母源抗体水平在1日龄时均达最高值,然后逐渐下降;肉鸡11日龄后H5、H9抗体滴度分别降低到4.2log2和4.3log2以下;蛋鸡28日龄后H5、H9...     

两种国产与一种进口小鼠肝炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较研究

目的 本研究拟对比小鼠肝炎病毒(MHV)抗体ELISA检测试剂盒的敏感性、特异性、精密性和可信度,以筛选出既经济又可靠的检测试剂盒.方法 选择两种国产与一种进口的ELISA试剂盒检测MHV抗体和以下5种病毒阳性血清:小鼠仙台病毒(SV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、小鼠细小病毒(MVM)、小鼠鼠痘病毒(MPV)及小鼠呼肠孤...     

禽流感与防疫

禽流感是一种由A型流感病毒的一种亚型(也称禽流感病毒)引起的禽类(家禽和野禽)和人的传染性疾病,被国际兽疫局定为甲类传染病,了解和认识禽流感的流行与病毒特点、传播途径、主要症状、扑灭措施及疫苗预防,对于控制和防止禽流感的发生,以及为人类健康都有着重大意义。     

猴B病毒BVgD-多肽ELISA检测方法的建立

目的建立猴B病毒抗体BVgD-多肽ELISA检测方法。方法以Western-blot分析猴B病毒糖蛋白D(BVgD)上的多肽抗原决定簇(BVgD-多肽)的抗原性,采用方阵滴定法,确定ELISA法的最佳实验条件。用灭活BV全病毒、HSV-1和BVgD-多肽三种抗原系统对猴血清样品进行平行检测,比较分析了三种系统的抗原性特点。并且将检测结果与美国BV抗体检测试剂盒的检测结果进行了比较。结果建立了猴B病毒抗体的BVgD-多肽ELISA法,研究结果表明本方法与BV全病毒和以HSV-1病毒为抗原的试剂盒相比,敏感性较低、特异性较好,避免了制备BV抗原对实验室要求高和HSV-1抗原引起的非特异性问题。检测结果与美国实验室BV抗体检测结果的符合率达85%。     

免疫学与生化方法检测C反应蛋白相关性分析

为比较酶联免疫双抗体夹心法与生化免疫比浊法在检测C反应蛋白方面的差异,并进行相关性分析,分别利用4个厂家酶免方法的超敏C反应蛋白试剂盒(HS-CRP)和1种生化方法的普通C反应蛋白(CRP)作为考核试剂盒,选择21例低中高值样本,采用双盲法与参比试剂盒做临床平行比对并进行相关性分析.结果表明,与参比产品相比,免疫学方法检测HS-CRP具有高度相关性,并且有较好的检测低限.得出免疫学与免疫比浊法试剂盒有较好的临床相关性,能较好的满足国际上心血管事件风险评估新标准规定的1 mg/L以下为低风险区的检测需要的结论.     

禽流感的流行现状、诊断与预防

禽流感是国际上公认的难以防治的鸡传染病之一，在世界各国的家禽和野禽中都有疫情出现，病毒侵入鸡群后，可出现30％～100％的死亡率，对养禽业的发展危害极大．通过对该病的流行病学调查、病毒的分离与鉴定、血清学检测，能够对该病进行准确的诊断，从而采取相应的防治措施，消灭疫情，减少损失．     

细胞ATP检测试剂的优化及其灵敏度的测定

为配制细胞ATP检测试剂并检测其灵敏度,按照常规报告基因分析试剂配制方法,将其中主要成分Luciferase(荧光素酶)和Luciferin(荧光素)及ATP浓度进行倍比稀释后找到最适合反应的最佳浓度值;按照最佳浓度配制反应液,将ATP浓度倍比稀释测定报告基因数值并绘制标准曲线,分析检测灵敏度;另外选取肿瘤细胞株H1299,倍比稀释后裂解细胞应用配制好的反应液进行ATP检测,分析最低检测细胞数。结果:Luciferase和Luciferin最佳反应浓度分别为1.25μg/mL和87.5μmol;按照最佳浓度配制反应液后,绘制ATP浓度标准曲线,找到ATP检测最低线为10-12mol/L,可以检测到H1299细胞最低值为100个。说明本实验配制的细胞ATP检测试剂灵敏度高具有良好的应用价值。     

鸭禽流感母源抗体的消长规律及其免疫效果

为研究鸭禽流感免疫程序,对不同日龄的雏鸭进行禽流感母源抗体的检测,并对雏鸭接种禽流感H5、H9二价油乳剂苗后的HI抗体水平进行了检测。结果表明,雏鸭的母源抗体水平在1日龄达最高值,然后逐渐下降;H5抗体20日龄后降低到4.5log2以下,H9抗体25日龄后降低到4.8log2以下。根据试验采用的免疫方案,对雏鸭在8日龄时进行首免,并多次免疫后可提高H5、H9抗体水平,有效预防禽流感的发生。     

树鼩粪便中病毒三种浓缩方法的效果比较

目的 比较树鼩粪便中病毒的三种浓缩方法,评价各方法的浓缩效果,为病毒浓缩方法的最佳选择提供依据。方法 将指示病毒(树鼩呼肠孤病毒,tree shrew’s reovirus, TRV)加入经离心过滤处理后的野生树鼩粪便上清中,采用PEG(聚乙二醇,polyehhylene glycol)沉淀结合超声分离法、铁离子絮凝的化学方法和GBviroFast病毒浓缩试剂盒对树鼩粪便上清分别进行浓缩,经实时荧光定量PCR技术对指示病毒进行绝对定量,比较各方法的浓缩效果。结果 TRV病毒悬液的载量为1.34E+05;铁离子絮凝的化学方法浓缩的TRV载量为1.86E+04,浓缩效率为49.57%;GBviroFast病毒浓缩试剂盒浓缩的TRV载量为0.98E+04,浓缩效率为26.12%;PEG沉淀结合超声分离法浓缩的TRV载量为2.30E+03,浓缩效率为6.13%。结论 三种方法均能浓缩粪便上清中低浓度的肠道病毒,铁离子絮凝方法最佳,GBviroFast病毒浓缩试剂盒其次,PEG结合超声分离效果最差。     

动物源性食品的氯霉素ELISA检测及分析

采用酶联免疫法检测了730例天津口岸进出口肉制品、水产品、乳制品和蜂蜜等几种动物源性食品中的氯霉素含量,对阳性结果经液相色谱-质谱联用EEC Cy3.6 confirming method进行确证,分析了其残留现状,并对英国RANDOX公司氯霉素检测试剂盒从检测范围、B/B050%抑制浓度、板内变异、板间变异、样品添加试验、实际样品检测、稳定性等方面各项指标进行试验.结果表明,试剂盒的检测低限为0.1 ng/mL,线性范围为0.05～4.7 ng/mL,B/B050%抑制浓度为0.4 ng/mL,样品加标回收率为80.5%～110%,板内变异系数小于5%,板间变异系数小于10%,试剂盒稳定性好.