表达cryIA/gna双价抗虫基因烟草兼抗棉铃虫和蚜虫

利用人工合成的、密码子优化后的雪花莲凝集素（ＧＮＡ）基因,与人工合成的ＣＦＭ ｃｒｙＩＡ构建了双价抗虫基因植物高效表达载体。通过根癌农杆菌介导转化烟草,获得２８株卡那酶素抗性植株,经ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹检测,证实了双价抗虫基因在烟草基因组中的整合,转基因烟草杀棉铃虫试验表明,４０％转基因烟草植株对棉铃虫具有高抗性;Ｂｔ杀虫蛋白ＥＬＩＳＡ检测获得与虫试较一致结果,抗虫性较强株Ｋ１１号ＣｒｙＩ     

其他寄主作物能成为Bt感性棉铃虫的庇护所吗?

害虫的抗药性是苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)微生物杀虫剂及转Bt基因抗虫作物在推广应用过程中潜在的巨大生态风险,建立庇护所、提供敏感种群是美国、澳大利亚等地在转Bt基因抗虫棉种植过程中采取的主要的抗性防治措施;而国内转Bt基因抗虫棉在田间多与其他作物套种,没有建立专门的庇护所。应用PCR指纹谱方法,检测了棉铃虫不同寄主种群的遗传差异,分析了棉铃虫不同寄主植物种群间的基因交流情况。结果表明,在田间棉铃虫的不同寄主种群中,Bt棉种群与普通棉花、玉米、蓖麻种群间基因交流频繁,而与芝麻、花生种群间交流存在一定障碍,彼此个体间不能进行随机交配,说明除普通棉花外、玉米、蓖麻能作为庇护所,防止棉铃虫对转Bt抗虫棉的抗性、而芝麻和花生不适于作为庇护所在田间与转基因棉花套种。     

转Bt 基因抗虫棉品种的推广利用与棉铃虫抗性的治理

我国现有３类转Ｂｔ基因抗虫棉种质材料：９４－２４,中心９４和Ｒ１９,它地棉铃虫初孵幼虫都表现出显著的抗虫性,用它们作亲本材料都已培育出转基因抗虫棉的品种或杂交种,这三类抗虫棉在不同生育期抗虫性表现程度不同,苗期（１０片主茎叶以下）吉处发孵死亡率一般达１００％,生育后期抗虫性则有所下降,Ｂｔ基因转发方棉花后能稳定遗传给后代,不同世代的抗虫性表现基本一致,通过室内汰选,烟芽夜蛾等害虫很容易对Ｂｔ杀虫     

利用ubi1内含子增强Bt cry1Ah基因在转基因玉米中的表达

Bt cry1Ah基因是从国内苏云金芽胞杆菌分离株BT8中鉴定克隆的新型杀虫蛋白基因. 本研究构建了两个含有Bt cry1Ah基因的植物表达载体, 在其中一个植物表达载体(pUUOAH)的玉米Ubiquitin启动子与cry1Ah基因之间插入了玉米泛素蛋白基因ubiqutin1的第一个内含子(ubi1). 利用基因枪法将其导入玉米(Zea mays L.)胚性愈伤组织中, 得到了可育的再生植株. PCR及Southern blot检测结果表明, cry1Ah基因已整合入玉米基因组中, 并稳定遗传至下一代. 对T₁及T₂代转基因植株进行ELISA检测, 发现pUUOAH载体转基因植株Cry1Ah蛋白的平均表达量提高了20%. 对T₂代转基因植株进行了田间抗虫性鉴定, 发现转cry1Ah基因玉米对玉米螟有很高的抗性, 并且pUUOAH载体转基因植株的抗虫性好于pUOAH(无内含子)载体的转基因植株. 以上结果表明, 玉米ubi1内含子可以有效增强cry1Ah在转基因玉米中的表达.     

RHL基因对粳稻的转化及转基因植株的耐盐性

通过农杆菌介导法把水稻类HAL2(RHL)导入粳稻品种合江19。根据GUS检测，RHL基因PCR检测和生长正常原则选择R0代单株。R1代株系中经抗潮霉素筛选后的阳性植株在苗期耐盐性有所改善，在孕穗期盐胁迫时细胞膜损伤小，叶组织活力强，耐盐性增强。对R1代株系进行Suthern杂交分析的结果证明，RHL基因表达框架已完整地整合进行了水稻基因组中。此外，对转基因育种方法和真正耐盐转基因水稻品种的培育等问题进行了探讨。     

在大肠杆菌和沙门氏菌中整合位点为tmRNA 的串联基因岛的模式和整合的时序性

tmRNA 是部分tRNA 和一小段mRNA 的结合体, 已被证明是作为基因水平转移产物之一的基因岛的整合位点. 我们通过序列比对和比较基因组学的方法确定了散布在肠杆菌科的13 个属中整合位点为tmRNA的68 个基因岛, 其中53 个基因岛属于大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella enterica). 在这53 个基因岛中, S. enterica subsp. enterica serovar Agona str. SL483 等8 个基因组, E. coli S88 和E. coli O55:H7 str. CB9615 中发现了2 个及以上连续的基因岛, 即形成了串联基因岛. 其中, S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium SL1344 中发现在该位点有3 个连续的基因岛组成的串联基因岛. 通过在大肠杆菌和沙门氏菌已测序的基因组中分析整合位点为tmRNA 的可变区, 发现大多数的基因组除了在可变区中包括了基因岛区之外, 还有一段残余的可变区. 确定了串联基因岛进入基因组的时间顺序, 即远离tmRNA 的基因岛先于靠近tmRNA 的基因岛整合进入该基因组中. 上述的基因岛中整合酶主要有3 种类型, 分别是HP1 整合酶, PhiCTX 整合酶和P4 整合酶, 以P4 整合酶所占的比例最多. 在串联基因岛中, 远离tmRNA 的基因岛中的整合酶是P4 整合酶, 其次是PhiCTX 整合酶,最靠近tmRNA 的基因岛所用的整合酶是HP1 整合酶, 由此可以得出tmRNA 是研究串联基因岛的遗传与进化的重要位点的结论.     

代谢型谷氨酸受体mGluR7的基因组结构及其家族蛋白胞外区的基因组结构比较

L－谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中的神经递质，其代谢型丙氨酸受体mGluR7在正常中枢神经功能和多种神经退行性疾病的病理发生中起着重要作用。为了研究mGluR7基因相关疾病的生物和遗传基础，通过从BAC文库中筛选种子克隆和对酶切指纹图谱数据库查询等方法，构建了 覆盖mGluR7全长基因的基因组物理图谱，并采用鸟枪法策略对图中BAC克隆进行测序与拼接组装，最终得到准确度为万分之一的完整的基因组序列。序列分析表明：mGluR7基因是长达880kb的超大基因；其基因组GC含量为38％，重复序列含量为37．5％，由11个外显子和10个内含子组成，其中5个内含子长度超过100kb，内含子1长达285kb； 存在2个替换剪接转录本mGluR7α和mGluR7b。通过比较mGluR7基因家族3组8个亚型受体蛋白胞外区的基因组结构，发现它们对应的基因组结构分为3组，组内各成员的基因组结构较为保守，而组间各成员的基因组结构保守性较差，这种基因组水平的组内保守和组间差异是和蛋白质水平上的保守和差异一致的，提示这些受体的基本功能在进化的过程中有明显的分化。在含mGluR7的组内，尽管组内各成员的基因组结构趋于保守，但大部分含子长度变化幅度很大，揭示基因组结构变化的程度高于蛋白质水平的变化，这种变化预期是在基因表达的调控上体现其生物属性的。     

代谢型谷氨酸受体mGluR7的基因组结构及其家族蛋白胞外区的基因组结构比较

L-谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中的神经递质, 其代谢型谷氨酸受体mGluR7在正常中枢神经功能和多种神经退行性疾病的病理发生中起着重要作用. 为了研究mGluR7基因相关疾病的生物和遗传基础, 通过从BAC文库中筛选种子克隆和对酶切指纹图谱数据库查询等方法, 构建了覆盖mGluR7全长基因的基因组物理图谱, 并采用鸟枪法策略对图中BAC克隆进行测序与拼接组装, 最终得到准确度为万分之一的完整的基因组序列. 序列分析表明: mGluR7基因是长达880 kb的超大基因; 其基因组GC含量为38%, 重复序列含量为37.5%; 由11个外显子和10个内含子组成, 其中5个内含子长度超过100 kb, 内含子1长达285 kb; 存在2个替换剪接转录本mGluR7a和mGluR7b. 通过比较mGluR基因家族3组8个亚型受体蛋白胞外区的基因组结构, 发现它们对应的基因组结构分为3组, 组内各成员的基因组结构较为保守, 而组间各成员的基因组结构保守性较差. 这种基因组水平的组内保守和组间差异是和蛋白质水平上的保守和差异一致的, 提示这些受体的基本功能在进化的过程中有明显的分化. 在含mGluR7的组内, 尽管组内各成员的基因组结构趋于保守, 但大部分内含子长度变化幅度很大, 揭示基因组结构变化的程度高于蛋白质水平的变化, 这种变化预期是在基因表达的调控上体现其生物属性的.     

利用EBV穿梭质粒表达人凝血Ⅸ因子的初步研究

目前开展的遗传病基因治疗研究大多是先取患者体细胞体外培养,通过反转录病毒感染使正常基因cDNA整合于基因组中,选择克隆、扩增,再将细胞植回病人体内.但有以下问题:(1)细胞表达水平的高低很大程度取决于基因的整合位置,各克隆的表达相差悬殊,虽可通过挑克隆解决这一问题,但挑克隆工作量大,且克隆细胞如传代次数过多亦不利于其表达.(2)病毒载体通常只带一份拷贝进入细胞,转基因产物的表达量不高,这样植回病人体内的细胞就需     

通过叶绿体基因工程在烟草中合成中长链羟基脂肪酸聚酯

中长链羟基脂肪酸聚酯(medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs)属于微生物聚酯. PHA合酶(PHA synthase, 由phaC基因编码)和3-羟酰基-酰基转移蛋白-辅酶A转移酶(3-hydroxyacyl-acyl carrier protein-coenzyme A transferase, 由phaG基因编码)是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶. 以aadA(氨基糖苷-3′-磷酸转移酶)基因做筛选标记, 分别构建了含phaC2基因的单价叶绿体转化表达载体pTC2以及同时嵌合phaC和phaG基因的双价叶绿体转化表达载体pTGC. 通过PDS1000/He基因枪转化法转化烟草, 获得具有壮观霉素抗性的叶绿体型转基因烟草植株, PCR和Southern Blot结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中且基本达到同质化. 气相色谱法检测转基因株系中的mcl-PHAs含量最高达4.8 mg/g干重, 合成的PHAs单体主要成分为3-羟基辛酸(3-hydroxyoctanoate, 3-HO)和3-羟基癸酸(3-dydroxydecanoate, 3-HD). 透射电子显微镜观察到转基因烟草叶片叶绿体中确有PHAs颗粒累积.     

转芪合酶基因植物中三羟基反式芪的功能

应用RT－PCR方法,从葡萄组织中克隆了两个芪合酶基因的编码区（1．19kb)。在大肠杆菌中能特异表达42ku的蛋白质,其分子量与芪合酶大小一致,并用其制备了兔抗血清。利用pBin438构建了植物组成型表达载体,经农杆菌介导获得转基因烟草植株。PCR,Southern blot,Western blot和RT－PCR分析证明该基因已整合到烟草的染色体中,并正常转录和特异表达。薄层层析和HPLC的结果进一步判断表达的芪合酶在烟草中可催化其底物合成3,4′,5－三羟基反式芪（trans-resveratrol),从转基因烟草中纯化的3,4′,5－三羟基反式芪能使人乳腺癌细胞停留在Go,G1期的细胞数增加。     

外源基因定向插入甘蓝型油菜C基因组

外源基因定向插入C基因组对于降低转基因甘蓝型油菜(Brassica napus, AACC)的生态环境风险具有十分重要的作用. 本研究利用农杆菌介导的遗传转化方法将抗除草剂bar基因转入到芥蓝(B. oleracea var. alboglabra, CC)中, 以转bar基因的芥蓝(C^bC^b)为父本, 非转基因的白菜(B. rapa, AA)为母本, 通过种间杂交、子房培养和染色体加倍, 获得bar基因定向插入C基因组的人工合成甘蓝型油菜株系67个. PCR结果表明, 人工合成的甘蓝型油菜bar基因为阳性的株系31个, 阴性的株系36个. Basta®喷施结果表明, 分子检测阳性的人工合成甘蓝型油菜高抗除草剂, 分子检测阴性人工合成甘蓝型油菜则不抗. Southern blotting分析结果表明, 外源bar基因已整合到人工合成甘蓝型油菜的基因组中.     

我国大豆主产区黑龙江省田间种植大豆的转基因成分检测

采集黑龙江省不同地区田间210份大豆检测样品, 利用定性PCR技术分析检测其中是否含有转基因成分(CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS基因). 结果表明, 210份样品中均未检测到CaMV35S启动子成分; 在13个样品中虽扩增出类似CP4-EPSPS的条带, 但对PCR产物的进一步酶切鉴定表明, 所有扩增结果为假阳性. 利用巢式PCR对样品0x1的进一步分析表明, 该样品中不含有转基因大豆(roundup ready)成分. 对0x1样品用CP4-EPSPS引物扩增得到的片段进行了测序. 序列分析表明, 该片段与CP4-EPSPS基因的同源性仅有81%, 再次证明它不是转基因大豆的CP4-EPSPS基因.     

转蚕丝心蛋白基因改良了棉花纤维品质

利用农杆菌介导法将蚕丝心蛋白基因(fibroin)导入陆地棉品系WC, 共获得了9块愈伤组织系的30株再生植株. PCR检测、卡那霉素抗性筛选和GUS组织化学分析均为阳性的有17株. 经连续4代的卡那霉素抗性筛选和PCR检测, 在T₃代获得了6个转化事件的转基因纯系. Southern blot和Northern blot结果表明, fibroin已整合到6个纯合株系基因组, 且能稳定遗传和表达. 扫描电子显微镜和纤维品质检测结果显示, 所有转基因纯合株系棉纤维的转曲数和纤维伸长率比对照明显增加, 部分株系比强度提高, 说明蚕丝心蛋白基因在棉纤维中特异表达影响了棉纤维的结构和品质, 可以获得纤维品质改良的株系, 有望在生产上得到应用.     

转基因小鼠乳腺表达重组人溶菌酶

人溶菌酶是由130个氨基酸组成的碱性多肽, 具有抗菌、抗病毒和增强免疫力的功能, 对生物体的自身防御起着重要作用. 为研究乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶和提高牛奶的免疫活性, 制备了以溶菌酶基因组序列为目标基因的表达载体的转基因小鼠模型. 经转基因小鼠的制备, 通过PCR和Southern blot 检测, 从83只出生小鼠中获得6只整合人溶菌酶融合基因的转基因小鼠. 对F1代小鼠的PCR检测表明外源基因可以遗传给后代. 在3只转基因阳性母鼠的乳汁中, 用Western blot方法可以检测到重组人溶菌酶的存在, 最高表达量达到0.2 mg/mL. 经活性检测, 转基因小鼠乳清的溶菌酶活性显著提高, 已达到人乳清溶菌酶活性的0.4倍, 而非转基因小鼠乳清具有极低的溶菌酶活性. 尽管转基因小鼠乳清中重组人溶菌酶活性还低于人乳清中溶菌酶活性, 但是转基因小鼠乳汁中的重组人溶菌酶与人溶菌酶具有相同的比活力. 为乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶的研究和开发应用打下了坚实的基础.     

卵黄蛋白原启动子驱动的防御素基因在转基因按蚊中的高效可调控性表达

遗传修饰蚊虫, 使其不传播疾病或使蚊虫种群密度下降, 是一种控制蚊媒传染病的新策略. 该策略实施的前提是能够改造蚊虫的基因组, 使得效应分子在适宜启动子驱动下, 在转基因蚊中高效特异表达. 本研究旨在评价冈比亚按蚊卵黄蛋白原启动子驱动的中华按蚊防御素基因在转基因斯氏按蚊中的表达效果. 克隆冈比亚按蚊卵黄蛋白原启动子序列, 并将其与已克隆的中华按蚊防御素基因顺式插入穿梭载体pSLFa, 然后再插入转化载体pBac[3xP3-DsRedafm]的AscⅠ位点; 将重组质粒pBac[3xP3DsRed-AgVgT2-DefA]和帮助质粒phsp-pBac DNA显微注射入斯氏按蚊的虫卵. 通过观察G1代幼虫眼部的特异荧光筛选出两株转基因阳性品系; Southern blot证明, 防御素基因的表达元件以单拷贝的形式插入到蚊基因组中; RT-PCR分析显示, 防御素基因在吸血后雌蚊的脂肪体中得到了特异高效表达, 而且防御素的表达比较内源性卵黄蛋白原能维持较长的时间, 因此多次吸血后的防御素表达呈现出可调性非周期型, 这对其发挥抗病原作用非常重要. 结果表明, 按蚊属蚊虫的卵黄蛋白原启动子和防御素基因在不同种按蚊中功能保守, 可以作为转基因抗疟研究中的候选调控分子和功能分子.     

利用体细胞核移植技术生产转基因牛

通过电穿孔的方法, 将含有新霉素抗性(Neo^r)基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体导入胎牛输卵管上皮细胞, 获得了转基因细胞株. 以转基因细胞为核供体, 进行了牛的体细胞核移植. 重构胚胎424枚, 其中208枚体外发育至囊胚, 囊胚发育率为49.1%. 选择第7天转基因囊胚17枚移入17头同期发情的受体牛子宫角内, 共有5头受体牛妊娠, 妊娠率为29.4%. 经过正常的体内发育, 有3头转基因克隆牛出生, 产犊率为17.6%. PCR和Southern检测结果表明, 3头转基因克隆牛的基因组中都整合有外源目标基因. 并且, 绿色荧光蛋白在转基因克隆牛的耳部皮肤组织以及从耳部皮肤组织分离出的成纤维细胞中均有表达. 上述结果显示, 通过体细胞核移植技术可以有效生产转基因牛; 所构建的双标记选择载体可以有效筛选出转基因细胞和转基因克隆胚胎, 应用于转基因克隆动物的生产, 确保所培育的克隆动物均为转基因动物.     

鸡生长激素基因单核苷酸多态与生长及屠体性状的相关性

以鸡生长激素(GH)基因作为控制鸡生长和屠体性状主基因的候选基因, 以明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的F₂代鸡群为实验材料, 通过PCR-RFLP方法对GH基因进行多态性检测. 在该基因内含子3中发现1处碱基突变: G →A, 由内切酶EcoR Ⅴ酶切证实; 在内含子4中发现1处碱基突变: C→T, 由内切酶MspⅠ酶切证实, 并由此对F₂代鸡群个体进行基因型鉴定. 方差分析结果显示, 在内含子3中的碱基突变与腹脂性状显著相关; 内含子4中的碱基突变与腹脂、胸肉屠体性状显著相关, 但两处突变与其他大部分生长和屠体性状相关不显著, 结果表明鸡GH基因可能是控制某些屠体性状的主基因, 或与控制这些性状的主基因紧密连锁.     

人的DNA指纹

一、引言遗传标志(genetic marker)是任何遗传学分析的基础。一直到70年代末,几乎所有的生化标志(biochemical marker)仅限于蛋白质的多态性(例如,若在血中出现大量的HbA(?)或大量的HbF,则可诊断为β地中海贫血)。随着DNA克隆技术和Southern杂交技术的应用,在基因组DNA水平上直接分析变异性(variability)成为可能.最初通过β珠蛋白基因族中限制性内切酶酶切片段长度变异的分析(例如,经Bam HI限制酶切割后,β~0地中海贫血患者出现含β     

陆地棉红株基因(R1)的精细定位

利用陆地棉遗传背景的海岛棉染色体16置换系材料Sub16和陆地棉多基因标记系T586创建了含1259个单株的F₂作图群体, 结合本实验室最新的栽培四倍体棉种种间分子遗传图谱上染色体16的标记信息, 利用分子标记技术, 对红株基因R₁进行精细定位. 在F₂分离群体中, 红株性状分离比符合孟德尔1:2:1的分离, 进一步证明该性状是由一不完全显性单基因控制. 利用JoinMap 3.0连锁分析软件, 使用含237个单株的F₂小群体完成红株基因R₁的初级定位, 进一步利用含1259个单株的F₂大群体将该基因精细定位在NAU4956和NAU6752之间, 与最近标记的遗传距离为0.49 cM. 研究结果为进一步克隆该基因及培育红色彩棉转基因品种提供了研究基础.