食肉目核糖核酸酶10分子进化研究

基于食肉目14个物种开展核糖核酸酶10RNase10分子进化研究,获得14条(RNase10)序列,氨基酸序列具有8个结构半光氨酸,但CKXXNTF功能区及催化活性氨基酸发生了改变,等电点明显低于核糖核酸酶基因(RNASE A)超家族典型成员RNase1-8,揭示食肉目RNase10可能失去了RNASE A超家族原有的宿主防御功能,而具有其他新功能.另外,基于RNase10构建的系统发育树为食肉目亲缘关系提供了一种可能性参考.总之,基于食肉目RNase10开展的分子进化研究,增加了该基因研究的多样性,为后续深入研究奠定了基础.     

奇蹄目核糖核酸酶基因超家族(RNASE A)的分子进化研究

为深入认识核糖核酸酶基因超家族(RNASE A),以奇蹄目的家马、驴、野马和白犀牛为研究对象,分析RNASE A序列、鉴定真假基因、预测等电点及构建系统发育树.结果揭示每个物种的RNASE A序列数并不相同,RNase4在该研究物种分歧之前发生1次基因复制,其中1个拷贝保留功能,另外1个拷贝发生假基因化并在不同物种中有不同程度的保留或丢失,而RNase2/3和RNase7/8经历"基因分拣"进化模式.另外,典型的RNASE A序列特征在RNase9—13中发生变异,揭示RNase9—13可能丢失核糖核酸酶活性而具有其他新功能.总之,该研究系统探讨了奇蹄目RNASE A的分子进化,增加了该基因超家族研究的多样性,为更加深入开展RNASE A研究提供了基础.     

小鼠线粒体DNA中一个新的R-loop结构的发现

哺乳动物线粒体DNA的D-loop区是其复制和转录的起始区域,其中D-loop重链RNA(DH-RNA)与复制和转录功能密切相关.但轻链RNA(DL-RNA)被认为没有重要的功能,因此几乎没有有关D-loop区的轻链RNA的研究.文中研究发现一个DL-RNA存在于小鼠线粒体D-loop区.研究表明这个DL-RNA跨越了几乎整个D-loop区,并且能够耐受RNase A和RNase T1酶的切割,但对RNase H酶敏感.在这种RNA存在的情况下,D-loop的DNA不能被HaeⅢ酶切割.这些结果意味着新发现的DL-RNA能同D-loop区的DNA形成三链结构,并且能使其对应区域的DNA不被限制性内切酶消化.在以细胞色素b基因为对照的实验中没有发现类似的结构,证明这一结构不是RNA转录过程中形成的临时结构.考虑到D-loop区是线粒体DNA复制和转录的重要调控区,这个新奇的三链RNA-DNA复合物可能在线粒体DNA复制和转录中扮演了重要角色.     

牛胰核糖核酸酶结晶的制备

牛胰核糖核酸酶(E.C 2.7.7.16)首先由Kunitz用硫酸铵分级盐析的方法获得结晶,然而在多次重结晶后仍含有微量蛋白水解酶的活性。McDonald利用加热的方法除去这些掺杂的蛋白质后,得到了无蛋白水解酶活力的纯牛胰核糖核酸酶结晶。随后,Hirs等将结晶RNase在IRC-50(XE-64)的树脂上层析分离,分出A及B二个组分,比例为10:1。Taborsky将结晶RNase在CM-纤维素上层析,得到一个主峰和三个小峰,都具有酶活力,主峰相当于RNase A。     

小分子RNA干扰技术的原理和应用前景

和传统基因抑制工具(如反义寡核苷酸和核酶技术等)比较,RNA干扰是源自细胞的内在的基因沉默机制,抑制基因表达具有广泛、高效和特异等优点.简要阐述了RNA干扰在基因功能分析中的作用和在疾病治疗中的应用前景.     

伤寒沙门菌非编码RNA AsrC表达特性及功能初步研究

非编码RNA在细菌的各种生命活动中都发挥着重要的功能.针对伤寒沙门菌非编码RNA AsrC,对其转录和降解特性及其所具有的功能进行初步研究.首先使用Northern blot和qRT-PCR的方法检测了σ因子rpoE和rpoS对AsrC转录的影响,分析了使用利福平抑制细菌RNA合成的情况下,RNase E和RNase III对AsrC降解的影响.其次使用AsrC缺陷株和高表达菌株分析细菌在酸、氧、高渗应激条件下的生长情况.再者通过全基因组芯片技术,研究AsrC高表达菌株基因表达的变化.进一步研究AsrC在细菌侵袭和巨噬细胞胞内生存力中的作用.结果显示,rpoE在酸应激下、rpoS在高渗应激下调节AsrC的转录.细菌中RNase E主要参与了AsrC的降解.高表达AsrC后,有40个基因表达上调,23个基因表达下调.AsrC高表达可以增强伤寒沙门菌对于上皮细胞的侵袭力,并且可以减弱细菌的胞内生存和增殖力.     

β-环糊精衍生物与核糖核酸酶的相互作用

用β-环糊精和对甲苯磺酰氯合成单-(6-O对甲苯磺酰基)β-环糊精,以合成的β-环糊精衍生物为主体,核糖核酸酶为客体,对比研究β-环糊精衍生物催化核糖核酸的水解和β环糊精衍生物非共价修饰的核糖核酸酶催化核糖核酸水解的酶活性,分析其催化活性的高低,并对其作用机理进行初步的探讨.β-环糊精衍生物具有水解核糖核酸的催化活性,能够非共价结合在核糖核酸酶上,形成的非共价修饰核糖核酸酶的催化活性比核糖核酸酶要高8.8倍.     

慢性萎缩性胃炎与正常胃活检组织RNA分布的研究

采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的核糖核酸酶（FITC－RNase）作为探针，结合半薄切片技术，观察了慢性萎缩性胃炎与正常胃活检组织中RNA的分布变化，结果表明：慢性萎缩性胃啖腺体细胞内RNA明显减少，分布部位与正常胃腺体细胞差异较大，这些结果于慢性萎缩性胃炎的病理诊断提供了一些依据，对进一步从分子水平上研究慢性萎缩性胃炎的病理变化及其与胃癌的关系具有一定的意义。     

猪Zfx基因RNAi片段的筛选

为了研究Zfx基因在精子发生过程中的作用,本实验利用RNA干扰技术针对猪Zfx基因m RNA的不同靶位设计构建了4个不同的sh RNA干扰载体:3个RNAi-Ready-p SIREN-Retro Q-Zs Green(p SIREN)质粒重组载体(a、b、c),1个p LL3.7慢病毒骨架质粒重组载体(p LL3.7-sh RNA)。通过对仔猪睾丸体外培养生精细胞中的Zfx基因进行人为干扰后,提取总m RNA,利用q RT-PCR对Zfx基因m RNA表达进行丰度测定。结果表明:p SIREN质粒重组载体干扰组对Zfx基因没有明显地作用,慢病毒骨架质粒重组载体干扰组对Zfx基因表达抑制效果显著,抑制率为51%(P﹤0.05)。结论:筛选获得了慢病毒骨架质粒重组干扰载体,其对仔猪睾丸体外培养生精细胞中的Zfx基因表达具有显著地干扰作用。     

啮齿目中RNase4基因的分子进化研究

RNase4基因是RNASE A基因超家族中的一个重要成员,是分子进化研究的最佳模型之一.首次在基因组水平对啮齿目中的16个物种进行RNase4基因深入分析.在白臀豚鼠、几内亚猪、鹿白足鼠和非洲跳鼠中检测到不同程度的RNase4基因扩张,并且经历了3次独立的基因复制事件.其中,在白臀豚鼠和几内亚猪中检测到1次基因复制事件;在鹿白足鼠和非洲跳鼠中发生2次基因复制事件,并且经历了"生与灭"的进化模式.     

丙酮酸激酶基因调控异色瓢虫生殖力的作用分析

丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PYK)是昆虫能量代谢过程中的一个关键酶.为探究该基因调控异色瓢虫(Harmonia axyridis)生殖力的功能,采用RNA干扰技术抑制PYK1-1基因的表达,测定产卵前期、30 d总产卵量、孵化率及关键基因的表达水平,并观察卵巢发育情况.将ds PY K1-1导入异色瓢...     

蛋白质超家族模体保守性及物理化学性质的分析

分析了全β类4个典型的蛋白质超家族中模体的功能,发现免疫球蛋白超家族和纤维结合蛋白类型Ⅲ超家族中的模体有相似的结构,但是它们行使不同的功能.血小板-白细胞C激酶底物的同源物结构域超家族和核酸结合超家族中的模体类型较多,虽然这些模体只是部分结构相似,然而它们却在各自的超家族中分别执行着相同的功能.文章进一步运用统计学方法研究了蛋白质超家族中保守模体的亲疏水特征、物理化学特征和结构特征.结果表明,模体差异有显著意义的残基存在于序列模体的保守位点上,相同的序列模体具有相似的二级结构.这些特征将对进一步识别超家族提供帮助.     

核酶的发现及其在基因治疗中的应用

核酶是具有催化功能的结构性RNA分子,且大多数核酶具有剪切RNAs的功能,可以利用它们剪切信使RNA(mRNAs)调节基因表达,从而作为基因治疗的新手段.阐述核酶的发现历程,以及其在艾滋病、肝炎、肿瘤和生殖道系统感染等基因治疗的研究进展.最后,分析核酶在基因治疗中的技术优势及存在问题,并对核酶领域包括更多核酶晶体结构的确立、酶切机理的理解、核酶新的生物学功能的发现等研究进行展望.     

皂土对RNA的有效分离和保护作用的初步研究

皂土-SDS RNA提取方法,是一种能广泛应用的RNA提取方法,能从富含多糖多酚的麻疯树,富含RNase 的动物肝脏,以及霉菌等多种RNA提取困难的动、植物与微生物材料中,成功提取出高质量的RNA,A260/A280在1.8以上．皂土对RNA酶具有高效吸附效应,与RNAsin比较,发现皂土抑制RNA酶强度比进口的同类产品更佳。同时,实验表明此皂土RNA酶抑制剂对RT-PCR等分子生物学后续实验的并无影响。结论：皂土成本低廉,可作为一种有效的RNA抑制剂.     

核糖核酸功能的研究进展及应用前景

<正>2016年11月6～8日,功能性核糖核酸国际研讨会在广州召开。本次研讨会由中山大学孙逸仙纪念医院与美国细胞出版社联合主办,以"Cell Symposia"为品牌,聚焦核糖核酸(以下简称RNA)的功能作用研究热点。会议邀请到2006年诺贝尔生理学或医学奖得主Craig C.Mello教授、中国科学院院士施一公教授、美国国家科学院院士Michael     

水稻OsWHY1基因克隆及过表达与RNAi载体构建

Whirly蛋白是一种单链DNA结合蛋白,是植物特有的存在于细胞核与叶绿体中的双定位蛋白.本研究以水稻品系金23B为材料,从cDNA中克隆得到水稻whirly蛋白基因(OsWHY1).该基因的c DNA全长为1 250 bp,开放阅读框大小为825 bp,编码274个氨基酸.结构域分析结果表明OsWHY1蛋白序列具有whirly蛋白家族共有的whirly结构域.蛋白质序列比对分析表明,OsWHY1蛋白序列与玉米(Zea mays),小米(Setaria italica),黍(Panicum miliaceum),高粱(Sorghum bicolor),大麦(Hordeum vulgare)的蛋白序列相似性分别为79. 8%、83. 1%、82. 7%、78. 7%和75. 3%.此外,本研究通过酶切酶连的方法成功构建了pU1300-OsWHY1过表达载体和PTCK303-OsWHY1 RNA干扰载体,为进一步研究OsWHY1基因在水稻持绿性中的功能打下基础.     

JcERF1基因RNA干扰载体的构建、转化及沉默效果研究

构建了麻疯树(Jatropha curcas)一个新的ERF类转录因子基因RNA干扰(RNAi)载体,并将之转入过表达JcERF1基因烟草体内, 得到了RNA干扰型烟草. 利用实时荧光定量PCR(QPCR)检测了JcERF1基因的表达量, 发现该基因在干扰型烟草中表达量明显降低. 通过野生型、过表达型和干扰型烟草的种子萌发实验和高盐胁迫实验发现: 与过表达型烟草相比, 干扰型烟草的抗盐能力明显降低, 且干扰型烟草的游离脯氨酸和可溶性糖含量在高盐处理后上升的幅度明显低于过表达型烟草. 以上研究结果说明JcERF1基因在干扰型烟草体内已被有效沉默, 同时说明该基因具有提高转基因烟草抗盐性的功能.     

人抗增殖蛋白Tob与其配体蛋白的相互作用及功能研究

抗增殖蛋白Tob作为BTG/TOB家族成员之一,对细胞增殖与mRNA降解具有重要作用.在磷酸激酶Erk1和Erk2的作用下,Tob中的3个丝氨酸位点可以进行磷酸化.已有大量研究表明Tob通过与去腺苷酸化酶中的核糖核酸酶D家族成员之一的Caf1相互作用于mRNA 3′端,共同组成去腺苷酸化酶复合体.同时,Tob对胞质多聚腺苷酸化因子结合蛋白3(CPEB3)对蛋白表达的负调控具有抑制作用.并且,Tob可以与多聚腺苷酸结合蛋白(PABP)相互作用,促进细胞内mRNA脱腺苷化.通过对Tob的3个参与磷酸化的丝氨酸位点进行突变,分别研究了人源野生型与丝氨酸突变型Tob对其与人源Caf1,PABP及CPEB3相互作用及多聚腺苷酸降解过程的影响.     

酵母质粒Killer系统的研究

从酿酒酵母中筛选出两个具有线状双链RNA质粒的酵母菌株,提取并纯化了它的质粒RNA.用RNase和DNase处理,发现它们能被RNase消化,证明它们是质粒RNA.用电镜观察到它们呈线状,凝胶电泳图谱表明,这些质粒RNA都含有两条带;其分子量分别为3.0×10~6d和1.5×10~6d。