酶法体外建立天冬氨酸酶基因的随机突变库

L-天冬氨酸酶(EC 4.3.1.1)是一种重要的工业用酶,用于酶法生产L-天冬氨酸。近年来,全世界对L-天冬氨酸的需要量稳定增长,因此,对该酶的理论与应用研究已引起广泛的重视,1984年Guest等报道了E.coli K-12菌株的天冬氨酸酶基因的克隆;1985年了akagi等报道了E.coli W菌株的天冬氨酸酶基因的克隆和核苷酸顺序,克隆株比原始菌株的酶活力提高2—3倍;1986年Woods等报道了E.coli K-12菌株的天冬氨酸酶的氨基酸顺序.并将含有天冬氨酸酶基因的质粒转化E.coli 294中,细胞酶活力提高约30倍;     

人神经生长因子β亚基的基因在P.pastoris和E.coli中的表达

将hNGFB基因插入甲醇营养性酵母P .pastoris分泌表达载体pHIL S1和E .coli表达载体pET 15b中 ,相应转化P .pastorisGS115 (Mut+,His- )和E .coliBL2 1(DE3 ) .在不含组氨酸平板上生长的酵母转化子通过PCR进一步筛选阳性克隆 ,P .pastoris重组菌株的蛋白电泳表明发酵液中有特异表达带 ,扫描分析占细胞外泌总蛋白的 14 .4% ,Westernblotting证实该分泌蛋白具有hNGF的免疫活性 .E .coli重组菌株在IPTG的诱导下表达融合蛋白 .电泳扫描分析表达的融合蛋白占细胞总蛋白量的 10 .3 % ,Westernblotting检测表明具有免疫活性 .     

BICP0和其环指结构域具有E3泛素连接酶活性

1型牛疱疹病毒(BHV-1)早早期(immediate early, IE)基因所编码的调控蛋白BICP0可决定病毒的感染方式, 具有多种转录调控功能. 它能促进病毒自身IE基因、早期(early, E)基因和晚期(later, L)基因以及其他一系列细胞基因的表达. 为研究其作用机理, 在E. coli中表达纯化了BICP0及其各种缺失突变蛋白. 体外活性实验表明, BICP0全长蛋白和其具有环指(ring finger)结构域的N端蛋白可以催化多聚泛肽链的形成, 具有E3泛素连接酶的功能, 暗示BICP0的转录激活功能可能通过其泛素连接酶功能实现, 为阐明BICP0在病毒感染中的作用机理提供了新视角.     

一种特殊拓扑学结构DNA的发现

从生物体中分离到的共价闭合环形DNA(ccc DNA)样品含有连系数不同的拓扑异构体。在DNA嵌入试剂的存在下,这些拓扑异构体可被琼脂糖凝胶电泳分离成连续的梯形区带。我们从一株Ⅱ型DNA拓扑异构酶缺陷的大肠杆菌(E. coli SD108 topA~+,gyrB 225,pyrF 287)细胞中抽提到     

测度值分枝过程的伴随卷积半群

设E是Lusin拓扑空间,(?)(E)是由E的所有开子集产生的σ-代数,即E的Borel σ-代数.以B(E)记E上所有有界(E)-可测函数的全体,B(E)~+表示B(E)中非负元素构成的子集.设M(E)是(E,(?)(E))上全体有限测度构成的空间并装备了弱收敛拓扑,则M(E)也成为Lusin拓扑空间.令M(E)°=M(E)\{o},其中o表示E上的零测度.集中于点x∈E的单位测度记为δ_x.对于f∈B(E)和μ∈M(E)记μ(f)=∫fdμ.假定X=(W,(?),(?),X_t,Q_u)是M(E)     

改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用

在延缓性免疫排斥反应(DXR)过程中, NF-κB发挥着关键作用. 如何恰到好处地抑制其活性是本领域研究的重要问题之一. 用改造的E1A基因(E1A)包括功能区(1 ~ 80氨基酸)和核定位区(139 ~ 243氨基酸), 删除其中可能对人体有害的CR2区, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3中, 并转染猪血管内皮细胞(PAEC), 经G418筛选, 获得稳定表达细胞株. RT-PCR技术和细胞生长曲线分析, 证明E1AΔ基因能在PAEC中稳定表达, 且不影响细胞的正常生长, 并能抵抗肿瘤坏死因子-α (TNF-α)诱导的细胞凋亡. 报告基因分析表明, E1A(能抑制由TNF-α诱导的NF-κB活性, 其抑制率为53%, 对NF-κB信号转导途径下游的一个重要炎症基因--E-选择素基因的表达抑制率达63%. 综上, E1AΔ基因的这些功能基本符合异种器官移植中克服DXR的要求, 为利用E1AΔ基因克服DXR的可行性提供了实验依据.     

Protein catenation in vivo

<正>With the support by the National Natural Science Foundation of China,the research team led by Prof.Zhang Wenbin(张文彬)at the Key Laboratory of Polymer Chemistry and Physics of Ministry of Education,Center for Soft Matter Science and Engineering,College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University,reported a strategy to synthesize protein catenanes via direct expression in E.coli.The     

κ改造的腺病毒5型E1A基因对TNF-α 诱导的猪血管内皮细胞中NF-κB活性的抑制作用

在延缓性免疫排斥反应(DXR)过程中, NF-κB发挥着关键作用. 如何恰到好处地抑制其活性是本领域研究的重要问题之一. 用改造的E1A基因(E1AΔ)包括功能区(1 ~ 80氨基酸)和核定位区(139 ~ 243氨基酸), 删除其中可能对人体有害的CR2区, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3中, 并转染猪血管内皮细胞(PAEC), 经G418筛选, 获得稳定表达细胞株. RT-PCR技术和细胞生长曲线分析, 证明E1AΔ基因能在PAEC中稳定表达, 且不影响细胞的正常生长, 并能抵抗肿瘤坏死因子-α (TNF-α )诱导的细胞凋亡. 报告基因分析表明, E1AΔ能抑制由TNF-α 诱导的NF-κB活性, 其抑制率为53%, 对NF-κB信号转导途径下游的一个重要炎症基因——E-选择素基因的表达抑制率达63%. 综上, E1AΔ基因的这些功能基本符合异种器官移植中克服DXR的要求, 为利用E1AΔ基因克服DXR的可行性提供了实验依据.     

在大肠杆菌和沙门氏菌中整合位点为tmRNA 的串联基因岛的模式和整合的时序性

tmRNA 是部分tRNA 和一小段mRNA 的结合体, 已被证明是作为基因水平转移产物之一的基因岛的整合位点. 我们通过序列比对和比较基因组学的方法确定了散布在肠杆菌科的13 个属中整合位点为tmRNA的68 个基因岛, 其中53 个基因岛属于大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella enterica). 在这53 个基因岛中, S. enterica subsp. enterica serovar Agona str. SL483 等8 个基因组, E. coli S88 和E. coli O55:H7 str. CB9615 中发现了2 个及以上连续的基因岛, 即形成了串联基因岛. 其中, S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium SL1344 中发现在该位点有3 个连续的基因岛组成的串联基因岛. 通过在大肠杆菌和沙门氏菌已测序的基因组中分析整合位点为tmRNA 的可变区, 发现大多数的基因组除了在可变区中包括了基因岛区之外, 还有一段残余的可变区. 确定了串联基因岛进入基因组的时间顺序, 即远离tmRNA 的基因岛先于靠近tmRNA 的基因岛整合进入该基因组中. 上述的基因岛中整合酶主要有3 种类型, 分别是HP1 整合酶, PhiCTX 整合酶和P4 整合酶, 以P4 整合酶所占的比例最多. 在串联基因岛中, 远离tmRNA 的基因岛中的整合酶是P4 整合酶, 其次是PhiCTX 整合酶,最靠近tmRNA 的基因岛所用的整合酶是HP1 整合酶, 由此可以得出tmRNA 是研究串联基因岛的遗传与进化的重要位点的结论.     

大肠杆菌合成中链脂肪酸研究进展

中链脂肪酸(medium-chain fatty acids, MCFAs)及其衍生化学品在能源、医药、化工等诸多领域具有重要的应用价值.微生物发酵生产MCFAs是一条绿色、可持续的路线.大肠杆菌(Escherichia coli)可利用天然脂肪酸合成(fatty acid biosynthesis, FAB)路径和逆向β氧化(reversedβ-oxidation, RBO)路径合成MCFAs. MCFAs生产存在链长难控制、合成效率低、细胞损伤大等问题.近年来,工程大肠杆菌合成MCFAs取得了重大进展.通过链长控制蛋白的筛选与改造, MCFAs合成特异性得以提高;通过增加前体供应和强化产物释放,对合成路径进行“推-拉”, MCFAs合成效率得以改善;通过膜工程改造、应激响应调控及适应性进化,工程菌株对MCFAs的耐受性得以增强.本文基于大肠杆菌合成MCFAs的两种路径,系统综述了近年来控制产物链长、优化合成路径和增强细胞耐受的工程化策略,并展望了后续改善MCFAs合成的研究方向.     

腺病毒5型E1A在毕赤酵母中的表达及对肿瘤细胞生长的抑制作用

腺病毒5型E1A(Ad5E1A)作为一个抑癌基因, 由于具有较强抑癌作用及显著的化放疗增敏作用而受到人们的关注. 但由于它能整合到宿主细胞基因组中长期表达, 并能使Rb基因失活, 使动物细胞永生化等而引起人们的担心. 为了避免E1A在基因治疗中存在的问题, 设想以E1A蛋白进行探索. 首先构建了E1A真核表达载体(pPIC9/E1A), 转化毕赤酵母(GS115), 筛选高表达重组菌株. 经摇瓶试验, 甲醇诱导表达3 d后, 分泌型的E1A蛋白经HiTrap Q 和HiTrap SP两步柱层析, 获得了较高纯度的E1A蛋白, 并经SDS-PAGE 和Western blot 鉴定. E1A蛋白经Chariot介导能顺利进入细胞, 并大部分定位在细胞核, 使LN686细胞发生明显的G2/M期阻滞, 体外能显著抑制LN686肿瘤细胞生长. 为利用E1A蛋白在肿瘤治疗中应用的可能性提供了实验依据.     

17β-雌二醇、壬基酚及其混合物对雄性泥鳅的雌激素效应

以卵黄蛋白原(Vtg)为生物标志物,采用半静水式暴露体系,研究了17β-雌二醇(E2)、壬基酚(NP)及其混合物对雄性泥鳅的雌激素效应.结果表明,与对照组相比,0.5μg/LE2在21d之内可诱导雄性泥鳅体内Vtg含量的增加,呈现时间-效应关系;NP也能诱导雄性泥鳅体内产生Vtg,呈明显的时间累积和剂量-效应关系,但其雌激素活性相对较弱;E2与NP混合物对雄性泥鳅体内Vtg的诱导也呈时间和剂量相关,其诱导能力显著性地强于单一化合物,且混合物对Vtg的诱导量高于两种物质分别作用时Vtg诱导量的简单加和.     

纤维蛋白高选择性尿激酶变体的研究

双链尿激酶(tcu-PA)作为最早进入临床使用的溶栓药物,由于它对纤维蛋白(fibrin)没有选择性,大剂量静脉注射时会使血液中纤维蛋白原(Fibrinogen)降解,从而引发出血,因此在临床应用上受到限制.单链尿激酶(scu-PA,又称尿激酶原)是tuc-PA的前体,但它不同于一般的酶原,具有一定的内在纤溶酶原激活剂(PA)活性,而且能选择性地在Fibrin表面活化纤溶酶原,从而选择性地溶解血栓凝块.scu-PA经纤溶酶(Plasmin)的作用在Lys158-Ile159肽键断裂,转变成tcu-PA,由Cys148和Cys279间形成的一对二硫键将两条钛链连接、我们以前的工作证明尿激酶A链的Lys151和Arg154氨基酸残基是导致双链尿激酶对纤维蛋白低选择性的结构基础.本文通过定点突变手段构建了变体尿激酶原(Glu151-Gly154-rscu-PA)基因(以下简称mscu-PA),并在E.coli中获得表达、测定了表达产物的双链形式mtcu-PA及未突变的重组尿激酶原(rscu-PA)及其双链形式(rtcu-PA)对Fibrin的亲和性以及对血浆中纤维蛋白的选择性,结果证明所得变体双链尿激酶对Fibrin具有较高的选择性.     

西沙群岛海域表层海水中微塑料的组成与分布特征

西沙群岛作为我国最大的海洋珊瑚礁区,目前对于微塑料这类新型海洋污染物的研究仍鲜见报道.本研究以西沙群岛海域30个表层海水中采集的微塑料为样本,对微塑料的空间分布、组成及可能的来源进行了定性和定量分析.结果表明:(1)微塑料广泛存在于西沙群岛海域表层海水中,丰度在10～130个/m3,长度多在1～3 mm之间(64.8%),形态主要为纤维和薄膜,颜色多属透明(56.8%)和蓝色(40.2%),化学组分主要是聚对苯二甲酸乙二醇酯(56.2%)和聚丙烯(20.3%).(2)微塑料在西沙群岛海域表层水体中空间分布不均,其分布主要受海水运动、人类活动以及地形地貌特征的影响.与国内外已有研究结果相比,西沙群岛海域表层海水中的微塑料整体处于较低的含量水平.(3)对微塑料形态特征和化学组成的分析表明,西沙海域高强度的渔业活动以及岛上人类活动释放的塑料垃圾可能是其主要来源.     

E玫瑰花形成对淋巴细胞内cAMP水平的影响

人的T淋巴细胞在体外能与绵羊红细胞(SRBC)自然地结合,形成玫瑰花样细胞团,称为E玫瑰花结.猪的T淋巴细胞也有类似效应.E玫瑰花实验现已应用于临床,而且从一般性观察机体的细胞免疫状态,发展到了恶性肿瘤等病人的特异性免疫测定.但国内外对与E玫瑰花有关的理论及应用等问题的研究尚不够深入,E玫瑰花形成的机制及其生物学意义有待进一步阐明.     

滨海湿地环境中微塑料表面性质及形貌变化

海岸带湿地是微塑料的重要聚集区.目前,对海岸带真实湿地土壤环境中微塑料表面形貌和性质变化研究甚少.本研究选取我国北方温带的黄河口盐沼湿地和南方亚热带的北部湾红树林湿地,以聚苯乙烯发泡和聚乙烯薄膜为受试微塑料对象,通过原位土壤掩埋(地下暴露)和非掩埋(地上暴露)定位试验和定期采样,观察和分析微塑料表面形貌、官能团、比表面...     

腺病毒E1和E4区基因共存的细胞系的建立

腺病毒载体相对安全,能有效地将外源基因转导到培养细胞或动物细胞中,但仍存在装载容量不够理想和免疫原性两个缺点.尤其是后一缺点,已成为制约其应用于临床基因治疗的主要因素.据认为,E4区基因在免疫原性中起着关键作用.因此人们希望通过发展E4区和Ela共缺陷的腺病毒载体,以降低或消除腺病毒载体免疫原性.这首先需要建立E4和E1区共存的包装细胞系,以互补腺病毒载体上E4和E1区功能的缺失,完成腺病毒载体的复制和包装.但有文献认为E4区和E1a不能稳定地存在于同一细胞中.我们成功地将腺病毒的E4区(pJM17的9724bp EcoRⅠ—XbaⅠ片段)插入AAV(Adeno-associated virus,腺辅助病毒)载体pAAV/neo中,并转导进293细胞(来自腺病毒E1区转化的人胚肾细胞,含有E1a区)中,得到了E1和E4区稳定共存的G418抗性细胞系.结果说明,E1和E4区可以稳定地共存于同一细胞,有可能建立无或低免疫原性,外源基因装载量由8kb扩大到17kb的新一代腺病毒载体系统.另外也表明,AAV载体介导的外源基因大小至少可达12kb左右(E4区9.7kb neo基因2.7kb=12.4kb).     

滨海潮滩土壤中微塑料的分离及其表面微观特征

微塑料(5 mm)作为海岸带地区的新型污染物正越来越受到关注.本研究以我国河北省曹妃甸围填海区潮滩土壤为例,采用自行改进设计的连续流动-气浮分离一体化装置,有效分离和提取了潮滩土壤样品中微塑料,并结合扫描电子显微镜-能谱仪(SEM-EDS)对微塑料表面的微观特性进行了表征.研究结果表明,供试土壤中微塑料丰度达到317 n/500 g(其中n表示微塑料个数),平均粒径为1.56±0.63 mm,其中1 mm的微塑料占49.8%;微塑料丰度上整体呈现随粒径变小而增加的趋势.在土壤中分离到碎片、颗粒、纤维和薄膜四类微塑料,其中,黑色碎片类微塑料为首次报道的类型.颗粒类微塑料丰度最大但平均粒径最小.土壤中微塑料表面均有不同程度的风化痕迹,具有不同形态和大小的微孔结构.在部分微塑料中还发现其表面附着稳定的铁氧化物.未来需要深入研究了解基于微塑料表面特性的污染物结合机制、生物积累与生态毒性,尤其更需关注丰度较高、颗粒更细的1 mm的这部分微塑料(MP1).     

常见塑料薄膜制品在UV作用下的性能变化特征

塑料自问世以来给人类的日常生活带来极大改变和方便,但同时由于其难降解性而产生大量塑料垃圾.这些垃圾在光、物理、化学和生物等作用下发生破碎降解产生微塑料,成为环境中微塑料的一个重要来源.本研究选取生活中常见的食品包装袋、垃圾袋、厚塑料膜和快递包装袋等塑料薄膜制品开展UV光降解实验,通过拉伸性能检测,结合红外光谱和扫描电子...     

高次非线性薛定谔方程(Ⅰ)

非线性薜定谔方程被用来描述各种非线性波动现象.目前研究得最广泛的是下述“立方薜定谔方程”: ia_tE a_x~2E |E|~2E=0 (1)式中,E(x,t)是波场(例如电场)的包络.方程(1)被证明是可积的,具有无限多个运动常数。采用散射反演方法,从方程(1)可得到碰撞不变的孤立波解.