小菜蛾钙黏蛋白PxCR_(10-11)结构域的克隆、原核表达及功能分析

钙黏蛋白(cadherin)是一类跨膜糖蛋白,因其在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的杀虫过程中作为主要的受体而受到广泛研究.钙黏蛋白的特征之一是由若干钙黏蛋白重复单元(cadherin repeats,CR)组成的长链状蛋白,其中靠近细胞膜的CR结构域被认为是钙黏蛋白与Bt毒素发生互作的区域.小菜蛾(Plutella xylostella)钙黏蛋白由11个CR结构域和1个跨膜结构域组成,其中第10和11个CR结构域PxCR_(10-11)被认为是钙黏蛋白与Bt毒素的互作区域.本研究从小菜蛾中肠cDNA中克隆得到小菜蛾钙黏蛋白PxCR_(10-11)结构域的DNA片段,并通过原核表达系统对PxCR_(10-11)结构域进行表达.配体印迹结果表明PxCR_(10-11)可以特异性和Cry2Ab结合;杀虫实验结果表明PxCR_(10-11)能提高Cry2Ab对小菜蛾的毒力.此外,利用蛋白质同源建模和糖基化位点预测网站对PxCR_(10-11)蛋白质结构进行了分析.上述结果表明PxCR_(10-11)可能参与了Cry2Ab毒素对小菜蛾的毒杀过程,为后续研究小菜蛾钙黏蛋白和Cry2Ab的相互作用机制奠定了基础.     

小菜蛾对杀虫双和杀螟丹抗性与艾氏剂环氧化活性

利用室内选育１１９代的抗杀虫双、抗杀螟丹小菜蛾品系和敏感品系,研究了各杂交世代小菜蛾对杀虫双和杀螟丹的敏感性．通过反复回交建立小菜蛾对杀虫双和杀螟丹抗性的近等基因系．测定了各杂交世代和近等基因系的多功能氧化酶环氧化活性．结果表明,抗性品系和抗性近等基因系多功能氧化酶环氧化活性比敏感品系高,杀虫双、杀螟丹抗性品系和杀虫双、杀螟丹抗性近等基因系分别是敏感品系的１．６２、１．８３、１．５６和１．９７倍,因此,多功能氧化酶环氧化活性提高与小菜蛾对杀虫双和杀螟丹抗性有关     

紫贻贝加工下脚料抗菌肽的分离及其稳定性研究

以紫贻贝加工下脚料为原料,采用超声辅助乙酸粗提抗菌肽粗提物,筛选其抑菌活性敏感指示菌。在此基础上,以固相萃取、Sephadex G-25层析和半制备RP-HPLC对抗菌肽进行分离纯化及其稳定性分析。结果显示,金黄色葡萄球菌为最敏感菌株,获得的Sp40-2-4和Sp40-2-5组分抑菌活性显著高于抗菌肽粗提物(P0.05),凝胶过滤色谱分析表明Sp40-2-4组分单一,相对分子质量约为1 970.78 Da;Sp40-2-4组分具有一定的热稳定性(100℃、20 min,抑菌活性残留率72.42%)、反复冻融性(冻融次数≤10,抑菌活性残留率91.42%以上)和抗胃蛋白酶水解能力(抑菌活性残留率75.59%)。     

溴氰菊酯胁迫下小菜蛾差异表达基因的筛选与分析

通过双向cDNA RDA,即分别以敏感品系为检测子(tester)、抗溴氰菊酯品系为驱赶子(driver)和以抗溴氰菊酯品系为检测子(tester)、敏感品系为驱赶子(driver)筛选2种品系中的差异表达基因,初步分析小菜蛾敏感品系和抗性品系之间的遗传差异.经过3轮消减杂交后,将所得的差异片段克隆于PMD 18-T载体,氨苄筛选阳性克隆,经菌落PCR鉴定后送样测序.得到2条序列与GenBank数据库中的部分已知序列有一定同源性,其中1条序列与编码S3a蛋白基因有较高的同源性.     

大肠杆菌诱导黄粉虫产生抗菌肽的提取及抑菌活性的测定

为了探究大肠杆菌对黄粉虫抗菌肽的诱导效果,采用不同方法处理的大肠杆菌诱导黄粉虫产生抗菌肽,经过诱导的黄粉虫于12、24、36、48、60、72 h时,分别粗提其中的抗菌肽,测定其浓度和抑菌活性,同时,统计了大肠杆菌诱导的黄粉虫体内细菌含量。结果表明:经诱导各个时间点的黄粉虫抗菌肽浓度均显著高于未诱导的黄粉虫组(P0.05),且在诱导48 h时产生的抗菌肽浓度最高,大肠杆菌和灭活大肠杆菌诱导黄粉虫产生的抗菌肽对3种细菌的抑菌直径均显著大于未诱导组,且对大肠杆菌抑菌力高于金黄色葡萄球菌和沙门氏菌(P0.05),大肠杆菌诱导48 h后的黄粉虫中细菌含量为9.5×10~4 CFU/g,低于国家规定标准饲料中细菌总数最低值2×10~6 CFU/g。提示,用大肠杆菌诱导黄粉虫能刺激黄粉虫产生高表达量的抗菌肽,并对大肠杆菌具有较强的抗菌性能且具有一定的安全性。     

α-螺旋抗菌肽YHX-1的从头设计及抑菌活性研究

抗菌肽因其高效的抗菌活性和独特的抗菌机制,不仅可作为生物防腐剂预防食品加工贮藏中的微生物腐败,还有望缓解抗生素滥用引起的耐药性问题。为得到一种高效安全的新型抗菌肽,以现有抗菌肽数据库为基础,确定优化了新型抗菌肽的序列长度、电荷数、氨基酸组成,并结合生物信息学预测及分析工具,从头设计得到了序列为GKLLSKLLKKLLK的新型抗菌肽YHX-1；通过琼脂扩散法、最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度及杀菌动力学曲线评价了其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌活性,并进一步测定了YHX-1在盐离子、血浆和微酸性环境中的稳定性、二级结构、溶血活性及细胞毒性。结果表明:YHX-1对6株指示菌均有良好抑菌活性,其中对单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的MIC为4μg/mL,在2h内对单增李斯特菌的致死率为99.99%。YHX-1在盐离子(200mmol/L Na⁺、2mmol/L Ca²⁺)和10%~25%血浆环境中均表现出一定的敏感性,MIC增至原来的2~8倍,而微酸性环境(pH值5.4~7.4)对YHX-1的MIC不会产生显著影响。圆二色光谱表明,YHX-1在细胞膜模拟环境中呈现典型的α-螺旋构象。溶血活性和细胞毒性实验表明,YHX-1具有较好的细胞选择性。YHX-1不仅抑菌谱广、抑菌活性明显,而且具有良好的安全性,有望作为新型抗菌剂应用于食品防腐保鲜,其从头设计策略旨在为新型抗菌肽的发掘提供参考。     

抗菌肽的抗菌机制及其在医药中的应用前景

随着抗生素副作用的日益凸显,以及其被批准数量的逐年下降,研发功能相似且不易产生耐药性的其他活性物质迫在眉睫。抗菌肽具有广谱抗菌性、热稳定性,作用机理独特,既能起到体内抗病菌感染、促进癌细胞凋亡的作用,还可作为抗病毒化疗剂和医疗器械的抗菌材料。系统综述了抗菌肽的抗菌机制,及其在医药领域抑制抗耐药菌的产生、抗癌以及抗病毒感染的作用,阐明了抗菌肽存在的稳定性、溶血性及毒性等问题,并对其发展前景进行了展望。指出今后可在以下方面对抗菌肽展开深入研究:1)结合体内抑菌机制进行研究,推动抗菌肽的开发应用;2)通过替换、修饰氨基酸残基,合成杂合肽,优化抗菌肽结构,提高其活性,降低毒副作用并预防耐药性的产生;3)利用抗菌肽传递系统或抗菌肽与绿色天然提取物联合作用,提高抗菌活性和生物利用度。     

小菜蛾对杀虫双抗性遗传的RDA分析

采用代表性差异分析法（RDA Representational difference analysis)初步研究了小菜蛾两个品系，敏感品系和抗杀虫双近等基因系之间基因组的差异，用敏感品系作为驱动扩增子（driver)，抗杀虫双近等基因系作为检验扩增子（tester)，通过四轮消减杂交后，得到两个差异片段，范围在150bp至300bp之间，初步判断这些片段何能与小菜蛾杀虫双抗性的遗传分子基础相关。     

溴氰菊酯抗感品系小菜蛾成虫差异表达蛋白的鉴定

通过对小菜蛾Plutella xylostella(L.)抗溴氰菊酯品系和敏感品系成虫双向电泳图谱的比较,找到8个差异明显的点,并结合质谱分析技术和数据库信息检索最终鉴定出7个蛋白.其中包括2个代谢相关蛋白,2个调控蛋白,1个结构分子蛋白,其余2个蛋白质功能皆不明确.这些在抗性或敏感品系中差异表达蛋白质的发现,为进一步研究小菜蛾抗药性形成机制和抗性相关蛋白的寻找奠定了基础.     

抗菌肽Lc-NKlysin-1a的抗菌稳定性及其抗菌机理

Lc-NKlysin-1是从海洋鱼类——大黄鱼(Larimichthys crocea)中获得的抗菌肽,为进一步优化该抗菌肽和研究其结构与功能的关系,本文截取了其N末端的12个氨基酸残基,设计并合成了抗菌肽Lc-NKlysin-1a,同时,通过琼脂板打孔法,对其抗菌活性,不同温度、pH值、盐浓度等对其抗菌活性的影响,其溶血活性,最低抑菌质量浓度,其抗菌特征等进行了研究,并在扫描电镜下观察了其对细菌形态结构的影响.结果表明:抗菌肽LcNKlysin-1a对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、抗链霉素大肠杆菌)均具有抗菌活性;但对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和抗链霉素大肠杆菌的抗菌活性最好,其最低抑菌质量浓度(MIC)在15.62531.25μg·mL~(-1)之间;相对于Lc-NKlysin-1,Lc-NKlysin-1a的抗菌活性明显增强;Lc-NKlysin-1a在15.62531.25μg·mL~(-1)时,其溶血率为3.80%7.37%,溶血活性较低;Lc-NKlysin-1a对温度、pH和盐等具有良好的耐受性,且稳定性高.此外,通过扫描电镜还观察到,抗菌肽Lc-NKlysin-1a作用于细菌后细菌的形态发生了明显改变,其细胞膜出现了褶皱和塌陷的现象,最终导致了内溶物外泻而死亡.改造后的抗菌肽其相对分子质量小,活性高,稳定性强,更易于被开发成抗菌肽类药物.     

响应面法优化金枪鱼蛋白抗痛风活性肽制备工艺

为制备具有抗痛风活性的金枪鱼蛋白肽,本研究以金枪鱼为研究对象,以蛋白回收率及XOD抑制率为指标,通过单因素实验选择中性蛋白酶和胰蛋白酶为复合酶,经响应面优化得到复合酶最佳酶解条件为:复合酶解温度45.5℃,加酶量935 U·g-1,复合酶解时间6.5 h;对于蛋白回收率,三因素影响顺序为:加酶量复合酶解温度复合酶解时间;对于XOD抑制率,三因素影响顺序为:复合酶解温度复合酶解时间加酶量。此条件下进行酶解,测得蛋白回收率为83.46%,与预测值偏差1.2%,比单一蛋白酶解提高36.1%;XOD抑制率为43.51%,与预测值偏差0.8%,比单一蛋白酶解提高54.4%,表明复合酶解后效果提高显著。此时酶解液主要含小分子肽,(1～3)KDa肽段含量为42.57%,1 KDa肽段含量为35.98%,大分子肽含量相比于未酶解时降低了90.7%。研究结果表明该复合酶法制取的金枪鱼抗痛风活性肽具有高蛋白回收率及良好的XOD抑制率,该技术对金枪鱼抗痛风活性肽的进一步深入研究和应用具有一定的理论指导意义。     

苏云金芽孢杆菌毒素Cry7Aa1三维结构模型

运用生物信息学软件和网络数据库资源,采取同源建模的方法以毒素蛋白Cry8Ea1为模板预测了苏云金芽孢杆菌毒素Cry7Aa1的三级结构并分析了相关的生物学功能.结果表明,Cry7Aa1为3个结构域组成的近似球状蛋白,Cry7Aa1在氨基酸序列上与Cry8Ea1有40%的同源性,在三维结构_ECry7Aa1与Cry8Ea1有高度的相似性,它们结构域Ⅰ几乎完全相同,在结构域Ⅱ之间和结构域Ⅲ之间存在较小差异.Cry7Aa1与Cry8Ea1的表面电势分布不同.2种毒素具有相似的毒杀机理.模型经Ramachandran图和Verify 3D检验具有合理性.     

厚壳贻贝抗菌肽mytichitin-CB的固相化学合成、复性及功能

抗菌肽是贻贝免疫系统的重要组成部分,也是开发新型生物抗生素的先导分子。厚壳贻贝抗菌肽mytichitin-CB是厚壳贻贝几丁质酶的C端天然裂解产物,具有几丁质结合结构域及抑菌活性。Mytichitin-CB分子在厚壳贻贝血清中含量极低,妨碍了后续研究。为深入研究mytichitin-CB的结构与功能,采用固相化学合成手段,成功合成了mytichitin-CB肽段,采用反相高效液相色谱和质谱对合成后的mytichitin-CB进行了纯度和精确分子量验证。通过氧化复性策略对合成后mytichitin-CB进行了成功复性,复性后的mytichitin-CB开展了抑菌活性测试,热稳定性和几丁质结合活性分析。结果表明合成mytichitin-CB对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌具有明显的抑制活性;经60℃温度处理后,其抑菌活性未见明显下降;合成mytichitin-CB与几丁质具有可逆结合作用。上述研究表明,合成mytichitin-CB具有与天然mytichitin-CB相似的结构与功能,可用于开展后续抗菌机制分析,同时,其较强的抑菌活性和较好的热稳定性为后续基于mytichitin-CB的生物抗生素研发奠定了基础。     

溴氰菊酯胁迫下小菜蛾泛素化蛋白的分析与鉴定

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western Blot和LC MS/MS技术,对在溴氰菊酯胁迫下的小菜蛾(Plutellaxylostella)四龄幼虫的泛素化蛋白(Ubiquitinated protein)的组分进行分析,结果表明小菜蛾溴氰菊酯敏感品系与小菜蛾溴氰菊酯抗性品系里的泛素化蛋白表达量有显著差异.本实验成功证明了在药剂胁迫下小菜蛾泛素化蛋白存在表达上的差异,该研究结果为分析昆虫细胞中泛素的功能及其对昆虫生理、生化和环境胁迫等方面的调节作用提供了参考.     

3-甲酰基色酮缩2-氨基芴席夫碱的合成与表征

原料芴经硝化、还原得到2-氨基芴,再与3-甲酰基色酮缩合得到相应的席夫碱化合物,利用IR,1H NMR和MS证实了目标化合物的结构,经体外抗活性研究表明,该席夫碱化合物有较强的抑菌活性.     

抗菌肽作用机制的研究进展

综述近年来有关抗菌肽抗细菌、肿瘤、病毒作用机制的研究进展。抗菌肽是广泛存在于多种生物中的一类带正电荷的小分子多肽,具有广谱抗菌活性,也具有抗真菌、肿瘤、病毒的活性。已有的研究普遍认为抗菌肽的杀菌机理涉及抗菌肽与细胞膜的相互作用,迄今大部分相关研究都集中在抗菌肽与细胞膜之间的相互作用上,抗菌肽还可以通过抑制细胞内生物大分子的合成来抑制细菌生长。     

蝇蛆抗菌肽对小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎治疗效果的研究

目的研究蝇蛆抗菌肽对小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎的治疗效果。方法本试验采用金黄色葡萄球菌诱导蝇蛆,从蝇蛆中提取抗菌肽并用于治疗金黄色葡萄球菌性乳腺炎。采用分娩后6～8 d的BALB/C雌鼠120只,随机分组:空白对照组、生理盐水治疗组、抗生素治疗组和抗菌肽治疗组,每组30只。空白对照组不做处理,另外3组用金黄色葡萄球菌感染小鼠建立小鼠乳腺炎模型,建模成功后,各试验组使用相对应的药物连续治疗7 d,并于第3、5、7天每组分别断颈处死10只小鼠,观察小鼠乳腺病理组织及HE染色切片,测定小鼠乳腺组织中TNF-α含量和金黄色葡萄球菌数量。结果经过金黄色葡萄球菌诱导产生的抗菌肽浓度显著高于未诱导组(P0.05)、对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性、对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1.5 mg/L,蝇蛆抗菌肽可显著抑制小鼠乳腺组织中金黄色葡萄球菌的生长(P0.05)、降低乳腺组织的损伤和极显著下调TNF-α的含量(P0.01)。结论蝇蛆抗菌肽对小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎治疗有一定治疗效果。     

镰刀菌毒素滤液对转基因香石竹抗枯萎病性能的测定

培育转基因香石竹是摆脱香石竹枯萎病的主要途径。通过检验转基因香石竹各品系对尖孢镰刀枯萎病的抗病性能,能够为抗枯萎病香石竹品种的选育提供理论依据。研究在探索适合尖孢镰刀菌产毒条件的基础上,用不同浓度镰刀菌毒素滤液对转基因香石竹28个品系进行了抗枯萎病性能的测定。测定结果表明:当温度为25~30℃、培养时间为15 d时,香石竹枯萎病菌在PSC培养液、全天振荡培养、连续黑暗的条件下最利于尖孢镰刀菌的产毒。不同p H对尖孢镰刀菌产毒量影响不大,毒素滤液经高温灭菌后其毒性变化也不大,说明该毒素具有较强的热稳定性。毒素培养滤液能够使香石竹叶片发病,且浓度越高,叶片发病率越高。当50%浓度毒素处理各转基因香石竹与其相应的未转基因香石竹叶片10 d时,叶片发病率差异达到了显著性差异的水平。通过50%毒素对香石竹各品系进行测定,发现转基因Ciao Bianco的叶片发病率在23.1%~27.1%之间,普通Ciao Bianco叶片发病率在53.8%~85.7%之间;转基因Tuareg的叶片发病率在25%~53.8%之间,普通Tuareg的叶片发病率在58.3%~78.6%之间;转基因Asso的叶片发病率在13.3%~43.8%之间,普通Asso叶片发病率在53.8%~66.7%之间。同时,确定Tuareg131、Tuareg133、Ciao Bianco179、Ciao Bianco416、Asso44、Asso 87、Asso 101、Asso 244为抗病品系。枯萎病镰刀菌毒素能够在香石竹抗枯萎病性测定起到重要作用,50%毒素浓度可用于筛选抗枯萎病的优良转基因香石竹,为转基因抗性品系选育和转基因香石竹抗病品系的推广种植提供依据。     

小菜蛾泛素基因的克隆及序列分析

设计了一对简并引物,从小菜蛾Plutella Xylostella(L.)抗溴氰菊酯品系和敏感品系的雌雄成虫基因组中分别克隆了泛素基因的编码区,GenBank登录号分别为EU28778,EU28779,EU28780,EU28781.序列分析表明,该基因的长度为228bp,编码的多肽由76个氨基酸组成.不同品系和不同性别的小菜蛾泛素基因的核苷酸序列、氨基酸序列等均存在差异,其中敏感品系雌雄成虫间差异较大,序列相似性为81.1%;抗性品系雌雄成虫间差异较小,序列相似性为97.8%.推测这些差异可能与小菜蛾抗药性的形成有关.因而为进一步研究小菜蛾抗药性形成机制和遗传机理奠定了基础.     

高压静电处理菜种对小菜蛾种群及生化特性的影响

为探究十字花科蔬菜常发害虫小菜蛾的物理防治技术，利用高压静电场处理上海青菜种，测定了不同处理时间下小菜蛾繁殖参数和抗氧化酶系的活性。结果表明，小菜蛾取食高压静电场（HVEF）处理过的上海青后发育受到抑制，产卵前期显著长于对照组；同时处理组的产卵期延长，随着处理时间增加产卵天数呈先上升后下降的趋势，在10 min处理下达到最低值；小菜蛾体内SOD活性呈上升趋势且显著高于对照组，60 min达到最大值；而POD与CAT活性显著低于对照组。酶活性的变化对小菜蛾体内MDA含量产生了显著影响。HVEF处理菜种主要通过改变小菜蛾体内的活性氧的水平，对小菜蛾的种群产生不利影响。研究为制定小菜蛾的生态防控策略提供了思路，为设施蔬菜行业的健康发展提供了实验数据。