错配PCR对牛X染色体相关基因杂合子的检测

利用DNA测序技术,在荷斯坦奶牛胎儿中找到X染色体基因GLRA2 3'端的杂合位点(C/T),设计错配引物在该位点对胎儿及其父本、母本基因组进行PCR扩增,建立起GLRA2基因的错配PCR技术,该技术可以快速在群体基因组中检测这一杂合位点.     

非整倍体和人类生殖健康

非整倍体即染色体数目异常,发生于生殖细胞则可能导致不育不孕、自发流产和先天出生缺陷.精子非整倍体发生率为5%～7%,卵子非整倍体发生率为22%～90%;在早期自然流产中,非整倍体率高达50%.绝大多数临床上常见的非整倍体患儿的异常染色体来自卵子(母亲),而且母亲减数分裂I同源染色体不分离是除13和18号染色体以外的各种常见染色体非整倍体的主要原因.母亲的年龄是迄今唯一被证实的与生殖细胞非整倍体发生密切相关的流行病学因素,减数分裂遗传重组(频率和位点分布)异常可能是导致减数分裂I同源染色体不分离的主要细胞学和遗传学因素,减数分裂前最后一次DNA复制时cohesin复合体的加载及其之后的维持异常则可能是引起减数分裂染色体不分离的分子生物学因素.减数分裂遗传重组和cohesin复合体的加载均发生于女性胚胎发育的8～30周,而非整倍体卵子的形成多发生在35岁以上的女性,因此我们认为导致非整倍体卵子形成的"罪恶种子"早在35年前即已埋下,随着女性年龄增大,其体内保障染色体精确分离的保护机制如纺锤体聚合检验点被"磨损"削弱,而最终导致减数分裂时染色体分离异常.未来的研究应着重探讨遗传重组改变的原因、机理及如何导致减数分裂染色体不分离,了解卵母细胞中cohesin复合体、纺锤体聚合检验点的功能是否随女性年龄增大而减弱及其生物学机制,从而为有效防止非整倍体的发生、减少人类生殖相关非整倍体疾病的发生提供理论基础.     

荧光定量PCR技术应用于早孕期胚胎染色体检查的研究

目的: 探讨应用荧光定量PCR(QF-PCR)法检查早孕期胚胎胚外体腔液(ECF)胎儿细胞染色体的可行性.方法: 32例孕6-10周正常妊娠选择性人工流产与宫内停育妊娠于宫内手术前行阴道超声引导下胚外体腔穿刺术,取ECF并提取DNA, 采用QF-PCR技术分析13,18,21号染色体数目,与绒毛长期培养染色体核型分析结果对比.结果:QF-PCR检测ECF成功率为 84.7%(27/32);正常妊娠组QF-PCR 检测13,18,21号染色体数目结果与绒毛长期培养染色体核型分析结果符合率100%;宫内停育妊娠组QF-PCR检查发现21-三体, 13三体, 18三体各1例,绒毛长期培养染色体核型分别为47xy 21/46XX(96%/4%),47XY 13, 48xy 10 18;另有46XX der (14;21)(p10;q10),47xy 16; 45XO各1例.QF-PCR检测目标染色体数目异常符合率为100%,不能检测染色体结构异常.结论:QF-PCR能够检测ECF目标染色体核型,结合胚外体腔穿刺术将目前的产前遗传学诊断时间提前至孕6-10周,是重要的早孕期胚胎染色体检查技术.     

2014-14 国外期刊亮点

正研究开发出验血查胎儿缺陷新法中国和美国研究人员5月5日在PNAS上发文称,他们开发出一种基于半导体芯片测序仪的无创产前诊断方法,可以根据孕妇血样检测出胎儿是否患唐氏综合征等与染色体异常有关的先天缺陷。这项由加州大学圣迭戈分校、广州医科大学、广东省妇幼保健院与广州爱健生物技术公司等机构研发的新诊断方法则基于新型高通量测序技术,只需抽取孕妇2 mL血样,就能诊断与染色体异常有关的先天缺陷,     

非整倍体胚胎发育中MSL复合体组分的RNA表达分析

MSL (male specific lethal) 复合体作为调节果蝇剂量补偿的关键元件，在非整倍体基因表达调控过程中发挥了重要作用．为深入探究非整倍体胚胎发育过程的分子调控机制，运用TSA-FISH (tyramide signal amplification- fluorescence in situ hybridization) 技术比较分析正常二倍体胚胎与常染色体三体胚胎中的MSL复合体组分基因表达模式，探究复合体重要组分在果蝇非整倍体胚胎不同时期的表达水平，以及亚细胞定位的变化．研究结果表明，在MSL复合体尚未组装的非整倍体胚胎发育早期，即母体表达阶段，多数复合体组分基因就已存在转录本水平上的差异，而这种表达差异主要源自于母体的非单倍体配子．随着发育的进行，染色体片段的增加导致基因组内剂量平衡发生变化，由此产生的反式剂量效应将引发MSL复合体各组分表达水平的差异变化，而这种差异将持续作用于后续非整倍体胚胎发育的各个时期．      

眼皮肤白化病Ⅰ型基因突变研究在产前诊断中的应用及一种致病性TYR基因新突变

目的:对1名生育过眼皮肤白化病(OCA)先证者母亲再次怀孕的家庭进行酪氨酸酶(TYR)基因突变研究和产前基因诊断.方法:应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TYR基因各外显子、外显子内含子交界区及启动子区,分别以异源双链分析法(HA)、变性高效液相层析(DHPLC)和DNA序列测定技术分析先证者及其父母的基因突变,明确突变的致病性后,检测胎儿TYR基因相应位点与基因型.结果:先证者的基因型为c.232_233insGGG/c.841G＞T,其父母基因型分别为c.232_233insGGG和c.841G ＞T突变杂合子.E281X具有致病性.胎儿未获得父亲的c.232_233insGGG突变和母亲的c.841G ＞T突变.HA和DHPLC法所获得结果与测序结果完全一致.结论:确定了先证者基因型,并检测出一种新的致病性突变c.841G ＞T.胎儿未获得致病性基因突变,具有正常的基因型.     

拉布拉多犬与金毛猎犬毛色基因MC1R(R306ter)与TYRP1(Q331ter)SNP位点的检测

目的建立犬毛色基因MC1R R306ter(c.C916T)与TYRP1 Q331ter(c.C991T)SNP位点的检测方法。方法采用PCR/测序的方法,对19只拉布拉多犬和15只金毛猎犬的MC1R基因c.C916T SNP位点及TYRP1基因c.C991T SNP位点的多态性进行检测,根据MC1R和TYRP1的多态性对犬的毛色基因型进行分析。结果 PCR/测序法能够对TYRP1基因c.C991T SNP位点进行明确和有效的检测。但MC1R基因c.C916T SNP位点的测序结果出现了特殊峰,经克隆/测序法确认该特殊峰型为杂合性SNP位点。毛色基因型分析表明,金毛猎犬的毛色基因型皆为纯合的eeBB(15只),未见其他基因型。拉布拉多犬的毛色基因型分别为:黑色犬EeBB(6只)、EeBb(2只);黄色犬eeBB(9只)、eeBb(2只)。未发现其他如EEBB和EEBb(黑色)、eebb(黄色)的毛色基因型。另外,拉布拉多犬样本中没有巧克力色犬,也未检测出其相应的Eebb和EEbb基因型。结论本研究成功建立了犬毛色基因MC1R R306ter(c.C916T)与TYRP1 Q331ter(c.C991T)SNP位点的检测方法,为分析毛色基因型与导盲犬培训成功率之间的相关性提供了前期工作基础。     

CML细胞抗原相关TCR Vα13／Vβ21和Vα18／Vβ21寡克隆T细胞及其CDR3序列特点

目的:分析慢性粒细胞白血病(CML)病人的克隆性增殖T细胞及其CDR3序列的特点。方法:利用RT-PCR和基因扫描分析1例CML患者外周血单个核细胞中的TCR Vα和Vβ基因的互补决定区(CDR3),了解各Vα和Vβ亚家族的限制性表达情况和T细胞克隆性增殖特点,寡克隆的PCR产物再进行序列分析。结果:该病人外周血T细胞表达18个TCR Vα和12个TCR Vβ亚家族,其中Vα13、Vα18、Vβ1和Vβ21亚家族呈寡克隆性。CDR3序列分析获得3个TCR克隆基因序列,分别为Vα13NJα49、Vα18NJα50和Vβ21NDβNJβ2.7。结论:获得1例CML病人外周血克隆性增殖αβ T细胞的3个TCR基因CDR3序列,提示病人可能存在与CML细胞抗原相关的Vα13/Vβ21或Vα18/Vβ21T细胞克隆。     

遗传性球形红细胞增多症——一家系中SPTA1基因突变分析及产前诊断

对1遗传性球形红细胞增多症(HS)家系进行基因检测分析,为家系成员提供遗传咨询和产前诊断。收集家系成员的临床资料,提取家系成员外周血及羊水细胞DNA,应用蛋白免疫印迹法(Western blot)分析红细胞膜蛋白缺陷情况,用高通量测序、PCR结合Sanger测序检测分析基因突变情况。Western blot结果显示:患儿及其父亲α-血影蛋白表达量减少。高通量测序、PCR结合Sanger测序发现患儿SPTA1基因中存在c.2179_2180delAG和c.3710AG复合杂合突变,分别来自父亲和母亲,均为新突变,其中c.2179_2180delAG为致病突变的可能性大。PCR结合Sanger测序检测胎儿羊水细胞DNA未发现其携带上述突变,胎儿娩出后随访与产前诊断结果一致。本研究发现2个SPTA1基因新突变,扩展了SPTA1基因突变谱,对HS的基因诊断和遗传咨询有重要意义。     

传代培养对嵌合型非整倍体计数嵌合比例的影响

探讨嵌合型非整倍体样本经传代培养后,对嵌合比例的影响。将两例(21-三体综合征、特纳综合征)嵌合型非整倍体患者外周血样本进行体外培养,72h传代一次,连续传代两次。用原位荧光杂交(FISH)技术检测原代、传代1、传代2样本中嵌合比例的变化情况。嵌合型21-三体综合征异常细胞比例分别为原代(189/200)、传代1(165/200)、传代2(139/200);嵌合型特纳综合征异常细胞比例分别为原代(142/200)、传代1(73/200)、传代2(55/200)。嵌合型非整倍体样本经传代培养后,异常细胞所占比例逐渐减少,利用传代细胞进行疾病诊断时容易出现漏诊或误诊,原代细胞更适用于疾病的诊断。     

中国大陆地区汉族15个常染色体STR基因座的突变分析

目的调查中国大陆地区汉族15个常染色体STR基因座(CSF1PO,D13S317,D16S539,D18S51,D19S433,D21S11,D2S1338,D3S1358,D5S818,D7S820,D8S1179,FGA,TH01,TPOX,v WA)的突变模式及突变率。方法采用Prep Filer~(TM)法医学DNA提取试剂盒、Amp Fl STR~Ientifiler~PCR扩增试剂盒检测19 037个三联体,根据等位基因突变的来源确定其突变模式并计算各基因座的突变率。结果在15个基因座中共观察到750例突变,且每个基因座均发现有突变个例;其中一步突变约占总突变的65%,二步突变约占18%,三步突变约占8%,四步突变约占2%;另外还观察到53例非整步突变,约占总突变的7%。每个基因座表现出的突变率各不相同,其中D13S317的突变率最高(5.97‰),而TPOX的突变率最低(0.53‰)。     

生物信息学及其研究现状

一、产生背景随着美国和英国科学家2006年5月18日在英国《自然》杂志网络版上发表人类最后一个染色体——1号染色体的基因测序[1],历时16年的人类基因组计划(HGP)书写完了"生命之书"的最后一个章节。     

河南两产地日本三角涡虫的染色体和核型多样性分析

利用空气干燥法对采自河南省桐柏县西小河和三里岔村两产地日本三角涡虫(Dugesia japonica)的染色体和核型进行了研究,结果表明:日本三角涡虫西小河种群的体细胞中染色体数目以16条为主,少数为24条和25条,分别占86.67%、6.07%和7.26%,染色体基数为8,为2倍体、3倍体和3倍性非整倍体的混合体,核...     

小反刍兽疫病毒融合蛋白基因的克隆、序列分析及表达

根据GenBank报道的小反刍兽疫病毒(PPRV)融合蛋白(F)基因序列,用特异性引物对PPRV疫苗株F蛋白基因进行了RT-PCR扩增,并将其克隆到pGEM-T载体中进行测序。结果表明:F基因ORF全长1641 bp,编码546个氨基酸;推导的氨基酸序列中第1~18位氨基酸构成信号肽序列,第488~510氨基酸为跨膜区。构建原核表达载体pETF1和pETF2,转化E.coliBL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blotting的分析结果表明,F1和F2基因在大肠杆菌中均获得了表达,且均具有良好的反应原性。用Ni-NTA试剂盒纯化F1和F2重组蛋白,为研发检测PPRV特异性抗体的诊断试剂奠定了基础。     

D16S539基因座中检出三带型等位基因及遗传分析

目的:在亲子鉴定案件中检出的D16S539基因座三带型.方法:提取个体不同组织样本DNA,经两种扩增试剂盒检测及DNA测序分析.结果:被检母亲D16S539基因座分型结果为9/10/11,阴阳性对照分型结果准确.结论:D16S539三带型非常罕见,该个体为正常成年女性,推测此三带型突变来源于杂合子局部的染色体重排或非整倍染色体.     

人凝血因子Ⅶ在CHO/DG44细胞中的表达

PCR法扩增FⅦ基因,构建重组表达质粒FⅦ-pOptiVEC,酶切、测序鉴定.脂质体法将FⅦ-pOptiVEC质粒转入CHO/DG44细胞,并用氨甲喋呤(MTX)进行分级加压筛选,获得高表达重组FⅦ蛋白的阳性细胞克隆.亲和层析法纯化FⅦ,并通过Western-blot检测蛋白表达情况.采用FⅦ促凝活性检测试剂盒(凝固法)检测FⅦ的凝血活性.结果表明筛选出的细胞克隆能稳定表达目的蛋白,MTX加压使其表达量明显升高.促凝活性检测结果证明获得的FⅦ蛋白具有凝血活性.     

鱼腥藻铁调蛋白基因(alr0957)表达和Fe~(3+)对藻生长的影响

根据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 FurC基因(alr0957)序列信息设计特异性引物,用降落PCR法从染色体DNA中扩增得约450 bp目的片段.运用TA克隆将其连接到pMD18-T载体上,经筛选测序获得阳性重组质粒.再经过双酶切、纯化FurC基因,连接原核表达载体pET-28a(+),并转化表达菌株BL21和IPTG诱导表达.经测序鉴定的阳性菌株中的FurC,运用SDS-PAGE检测重组蛋白,并利用镍柱层析法纯化目的蛋白.由藻细胞密度、叶绿素a含量、可溶性糖含量等改变探讨不同Fe3+浓度对藻类生长的影响.结果表明:在37℃经1 mmol/L IPTG诱导18 h,成功表达了分子量约为19000的融合蛋白.小于0.5mg/L Fe3+促进藻生长,大于0.9 mg/L Fe3+抑制藻生长,最适藻生长Fe3+浓度为0.5⁰.9 mg/L.     

两重巢式PCR检测母体外周血中胎儿游离DNA

使用两重巢式PCR技术检测母体外周血中胎儿游离DNA,为非损伤性产前鉴定胎儿性别和诊断单基因疾病奠定基础.采用改良的chelex100方法提取60例孕龄为16~36周孕妇的外周血浆中游离胎儿DNA,依据NCBIX染色体长臂ATL1位点,Y染色体上DYS14位点序列,设计并合成引物,用巢式PCR同时扩增2个基因片段,以鉴定胎儿性别.结果表明:有ATL1位点和DYS14位点的扩增产物261bp和198bp鉴定为男性胎儿,而仅有261bp扩增产物鉴定为女性胎儿.均以真实出生性别进行确认后发现,此方法能有效提高检测特异性.两重巢式PCR能够简便并准确地鉴定胎儿性别,对单基因疾病特别是X-连锁遗传病的诊断有积极意义.     

河南太行山脉3产地淡水三角涡虫染色体数目及核型多样性分析

利用空气干燥法对采自河南境内太行山脉十字岭、张沟、八里沟3产地淡水三角涡虫(Dugesiasp)的染色体和核型进行了研究.结果表明:十字岭淡水三角涡虫(Dugesia sp)体细胞中染色体数目以24条为主(2n=3x=24=24m),占84.56%,少数为16条(2n=2x=16=16m),占8.98%,染色体基数为8,为二倍体和三倍体的混合倍体;张沟淡水三角涡虫(Dugesiasp)体细胞中染色体数目以25条为主(2n=3x+1=24+1SB=21m+3sm+1SB),占80.84%,含有一条小B染色体,少数为24条(2n=3x=24=21m+3sm),占15.99%,极少数为32条,占3.17%,染色体基数为8,为三倍体、四倍体和三倍性非整倍体的混合倍体;八里沟淡水三角涡虫(Dugesiasp)的体细胞中染色体数目以24条(2n=3x=24=24m)和32条(2n=4x=32=32m)为主,分别占38.21%和39.77%,染色体基数为8,为三倍体和四倍体的混合倍体,该产地部分三倍体个体体细胞中染色体结构发生变异,个别染色体末端有随体,其核型呈现多型性.     

产前诊断先天愚型综合征的核型与氨基酸的研究

本文是产前诊断研究连续生两胎Down's氏综合征患儿,我们通过羊水细胞与胎儿脐带血细胞培养,进行染色体G分带及高分辨的分析,确诊胎儿核型为21三体(47,XX 21).人工流产的胎儿表现为眼距宽,鼻梁扁塌,耳下位,伸舌张口,手通贯掌,草鞋脚和大姆趾与二趾分开等征状.胎儿羊水氨基酸分析,苏氨酸979.34Ngram,比对照组高,这种异常可能与染色体畸变导至基因调节活动异常有关.产前诊断研究染色体与氨基酸的异常在遗传病的预防与优生都是很重要的.