赤点石斑鱼MHC IA基因的克隆与表达多态性分析

采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)非特异性免疫因子MHC IA基因的4个cDNA全序列,序列全长为1 680bp,含有3′UTR、启动子、多肽结合区(α1)、IGC区(α2)、跨膜区、胞质区和5′UTR区,编码区大小为1 074～1 080bp,共编码357～359个氨基酸,推测蛋白质分子质量约41.66ku.氨基酸序列分析发现赤点石斑鱼MHC IA分子具有经典MHC蛋白分子的空间结构,在多肽结合区则存在极其丰富的变异.利用Real time PCR和SSCP技术研究了赤点石斑鱼MHC IA的组织表达特异性和表达多态性,发现其在头肾、心、肝等12个组织器官中均能有效表达,在头肾,脾,胸腺等免疫组织表达量不仅高,表达多态性也异常丰富,而在与外界环境接触较多的鳃、肌肉、肠等组织表达较弱.此外,根据MHC IIB分子中相对保守的IGC区氨基酸序列构建了脊椎动物的系统进化树,也表明了该分子的IGC区氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好标记.     

赤点石斑鱼4种同工酶的组织分布及基因位点分析

运用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法对赤点石斑鱼7组织(肌肉、肝脏、肾脏、心肌、脑、脾脏、性腺)的4种同工酶(EST、LDH、MDH、ME)进行了初步研究,并对4种酶的同工酶位点及酶谱表型进行了分析.结果表明:赤点石斑鱼的4种同工酶系统具有明显的组织特异性;EST由4个基因位点编码;LDH酶带多于典型的5条酶带;MDH具有线粒体型(m-MDH)和上清液型(s-MDH)两种类型;7种组织只检测到一种类型的ME.     

赤点石斑鱼ICLP基因的克隆和序列分析

MHC class II invariant chain-like proteins(ICLP)因子与免疫反应密切相关,其参与对抗原的处理,保证多肽不被进一步降解为氨基酸.通过RACE反应获得赤点石斑鱼ICLP2cDNA全序列,全长1 837 bp,包括44 bp的5′UTR区,861 bp的开放阅读框以及932 bp的3′UTR区.编码286个氨基酸,推测的蛋白质分子量为31 878 u.对赤点石斑鱼10个组织的ICLP2基因进行PCR扩增和测序,结果表明赤点石斑鱼ICLP2基因的表达不存在组织特异性.此外,氨基酸序列同源比对的结果表明,赤点石斑鱼与其它16种脊椎动物ICLP2的相似度在25%～78%之间,与狼鲈和鳜鱼ICLP2因子的同源程度最高,分别为78%和74%.根据ICLP的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树,表明了该分子的氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好指标.     

赤点石斑鱼♂与斜带石斑鱼♀杂交的初步研究

叙述了4批赤点石斑鱼♂与斜带石斑鱼♀杂交的初步结果。用人工授精的方法可以取得杂交受精卵,受精卵的受精率、孵化率和仔鱼的畸形率与雌鱼的卵质有关;杂交组与对照组的斜带石斑鱼相比,受精率、孵化率和畸形率无显著差异,但发育速度较快;杂交组仔鱼与对照组仔鱼在孵化后11 d内的生长速度差异不显著,但12 d后杂交组仔鱼增长显著;杂交组仔鱼的不投饵活力系数SAI和育苗成活率较对照组显著高,初步表现出杂交的优势。     

赤点石斑鱼精子发生和形成的超微结构研究

用透射电镜研究了赤点石斑鱼Epinephelus妇精子发生和精子形成过程。结果表明，赤点石斑鱼精子发生经历了初级精原细胞、次级精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞阶段。精子细胞再经过精子形成过程成为精子。在初级精原细胞、次级精原细胞阶段，细胞核释放出拟染色体。拟染色体分布于精原细胞和前期Ⅰ的初级精母细胞的细胞质中。初级精母细胞减数分裂早期同源染色体配对明显可见，并形成联会复合体。精子细胞之间存在细胞联系（桥粒）。赤点石斑鱼成熟精子的特点是细胞核圆形，核内染色质致密，没有核泡（核空隙）。精子尾部细长，横切面为典型的“9＋2”轴丝结构。     

赤点石斑鱼脑垂体超微结构的初步研究

 应用透射电镜技术观察不同时期的性成熟赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）脑垂体的超微结构。结果表明,性成熟赤点石斑鱼脑垂体近椭圆形,由神经垂体和腺垂体两部分组成。神经垂体主要由神经纤维、脑垂体细胞和微血管组成。其中神经分泌纤维存在A(A1、A2)和B型神经分泌纤维。腺垂体中外侧部（PPD）腺细胞由嗜酸性的GH细胞和嗜碱性的TSH细胞及GTH细胞3类细胞构成。在不同的时期,GTH细胞内的分泌颗粒明显不同。     

斜带石斑鱼白细胞介素8基因的克隆与表达分析

为了研究斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)白细胞介素8(IL-8)的结构和功能,本实验对其基因序列进行了克隆和分析. 运用RACE-PCR方法,从斜带石斑鱼总RNA反转录cDNA库中获得了961 bp 长的cDNA全序列. 同时利用RT-PCR 技术,检测了微壁溶球菌诱导前后该基因在斜带石斑鱼体内不同组织之间的表达差异. 结果表明,斜带石斑鱼IL-8cDNA序列包含235 bp 的5′非编码区,438 bp的3′端非编码区和288 bp 的开放阅读框,编码95个氨基酸. 未诱导前,斜带石斑鱼IL-8基因主要在心、头肾、脾和肝脏中表达,在鳃和肠中量表达,在胃、肌和皮中几乎没有表达;诱导后,IL-8基因强烈表达于所有取样器官. 所获得的斜带石斑鱼IL-8基因是一种与炎症作用有关的CXC亚族趋化性因子.     

野生与饲养赤点石斑鱼肌肉营养成分的比较研究

本文对野生赤点石斑鱼（Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓａｋａａｒａ）和在水泥池内用种（Ｃｕｒａｎｇｉｄａｅ）鱼类饲养一年的赤点石斑鱼肌肉中粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、Ｃａ和Ｐ含量以及氨基酸种类与含量进行测定。经比较分析得出：饲养赤点石斑鱼肌肉中粗蛋白质为８４．７５％低于野生鱼的９２．５４％；粗脂肪为７．７６％高于野生鱼的１．５４％；而在粗灰分、Ｃａ和Ｐ的含量上两者相近。饲养赤点石斑鱼肌肉中氨基酸总量为７３３．５ｍｇ／ｇ，必需氨基酸总量为４０４．１ｍｇ／ｇ，鲜味氨基酸含量为３２６．４ｍｇ／ｇ，均分别低于野生鱼的８０６．２ｍｇ／ｇ、４３７．３ｍｇ／ｇ和３５６．８ｍｇ／ｇ；饲养鱼肌肉中各种氨基酸含量除精氨酸外均低于野生鱼。产生以上差异的原因，认为是不同的饵料种类因其营养成分的差异而影响了赤点石斑鱼肌肉中的营养成分。     

斜带石斑鱼、赤点石斑鱼RAPD和线粒体Cyt b基因序列变异分析

斜带石斑鱼和赤点石斑鱼为具有重要经济价值的海水鱼类。对这两种石斑鱼进行了随机扩增多态DNA(RAPD)和线粒体细胞色素b(Cyt b)基因序列变异分析。计算多态位点百分率、基因多样性和香农信息指数等遗传参数,以此评估种内遗传变异水平;通过统计变异位点、平均核苷酸差异数、核苷酸多样性以及种间平均每位点核苷酸替代数进行基因序列变异分析,并构建UPGMA系统树。结果表明:斜带石斑鱼的遗传多样性水平高于赤点石斑鱼,这可能与它们在种内特定遗传结构、分布范围大小、自然资源状况的差异有关;斜带石斑鱼和赤点石斑鱼之间检测到的种特异RAPD条带以及基因序列的变异,可作为种间分子鉴定标记。     

赤点石斑鱼配合饵料物理性状的初步研究

本文以赤点石斑鱼为对象，研究凶猛捕食性鱼类对饵料物理性状的要求。试验结果表明：影响石斑鱼摄食行为的主导因素是食物的ｚ运动特点；对于石斑鱼，软性颗粒饵料的适口性明显优于硬性颗粒饵料；其对颜色浅而明亮的物体的感受程度高于颜色深而暗的物体。     

日本囊对虾电压门控钠通道基因克隆与组织表达

利用基因克隆等分子生物学技术,获得日本囊对虾(Marsupenaeus ja ponicus)的电压门控钠通道(voltage-gate sodium channel,VGSC)蛋白的部分eDNA序列,获得的片段核苷酸长度为2 877 bp,可编码954个氨基酸残基,总分子质量约为108.2 ku.与同源蛋白比较结果显示,日本囊对虾的VGSC序列与其他一些物种具有较高相似性,特别是跨膜蛋白结构域具有极高的保守性.基于VGSC氨基酸序列比对绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测日本囊对虾VGSC的组织表达,结果显示VGSC表达与各组织的功能有极其密切的关系.VGSC mRNA在脑神经节中表达量最高,其次为肝胰腺,说明了钠通道在神经信号传导以及调节内分泌中都起到了重要的作用.     

葱莲凝集素基因的克隆

RACCE－PCR技术从葱莲叶片中克隆出葱莲凝集素的全长cDNA，通过比较葱莲同其它石蒜科植物的凝集素基因序列和推测的氨基酸序列，发现葱莲凝集素基因编码一具有信号肽的前体蛋白，葱莲凝集素同其它石蒜科植物凝集素一样为具有3个甘露糖专一结合盒的凝集素。     

毕赤酵母△~9-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,获得一个741 bp的毕赤酵母cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′和5′序列,从而得到全长为1 689 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 194 b p、编码397个氨基酸的开放阅读框(PPD9).与报道的Δ9-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的C-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ9-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列PPD9亚克隆到表达载体pYES 2.0,构建重组表达载体pYPPD9,并转化到酿酒酵母的Δ9-脂肪酸脱氢酶缺陷型菌株DTY-11A中进行表达。通过平板互补实验结果表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有Δ9-脂肪酸脱氢酶活性,能弥补DTY-11A中由于Δ9-脂肪酸脱氢酶的缺失而引起的致死性突变。     

半夏凝集素基因的克隆

利用RACE－PCR技术从半夏花序中克隆出半夏凝集素的全长cDNA,通过比较半夏同其他天南星科植物的凝集素基因序列和推测的氨基酸序列,发现半夏凝集素基因编码一具有信号肽的前体蛋白,半夏凝集素同其他天南星科植物凝集素一样,为具有3个甘露糖专一结合盒的凝集素。     

石蒜凝集素基因的克隆

用石蒜科植物凝集素基因的保守序列为引物，利用RACE－PCR技术从石蒜幼嫩叶片中克隆出石蒜凝集素的全长cDNA，通过比较石蒜同其他石蒜科植物凝集素基因序列和推测的氨基酸序列，发现石蒜凝集素基因编码一具有信号肽的前体蛋白，石蒜凝集素同其他石蒜科植物凝集素一样为具有3个甘露糖专一结合盒的凝集素。     

诸葛菜EPSPS基因5′端的克隆和序列分析

烯醇式丙酮基莽草酸 3 磷酸合成酶(5 enolpyruvylshikimate 3 phosphatesynthase,EP SPS)是植物和微生物莽草酸途径中的一个必需合成酶,植物中该基因的超量表达或该基因中某些氨基酸突变可以产生对除草剂草甘膦(glyphosate)的耐性.采用5′ RACE技术从诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)叶中克隆出一条长743bp的cDNA片段.序列分析结果表明:该cDNA与其它植物的EPSPS基因具有相当高的核苷酸序列同源性.其所编码的氨基酸序列与欧洲油菜(Brassicanapus)同源性最高为90%,与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、西红柿(Lycopersiconesculentum)、烟草(Nicotianatabacum)和水稻(Oryzasativa)的同源性分别为88%,81%,64%,62%和71%.