负载SIV抗原肽的中国恒河猴Mamu-B~* 1703可溶性单体及其四聚体的制备和鉴定

目的:制备负载SIV抗原肽的中国恒河猴Mamu-B*1703可溶性单体及其四聚体.方法:以含Mama-B*1703重链cDNA序列的pMD19-T克隆为模板,通过PCR的方法克隆Mama-B*1703重链基因,进而构建羧基端融合生物索化酶BirA底物肽(BSP)的Mamu-B*1703重链胞外域融合蛋白的表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.β微球蛋白、SIV抗原肽共存时,通过稀释法复性可溶性Mamu-B*1703单体,经生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4:1的比例混合形成四聚体.结果:ELISA检测显示获得具有正确构象的负载SIV抗原肽的Mamu-B-1703四聚体.结论:印度恒河猴Mamu.B}1701特异性抗原肽IW9,与中国恒河猴的Mamu-B*1703相结合形成可溶性Mamu-B*1703/IW9单体和四聚体.     

基于COX-2的食管癌广谱CTL表位筛选及鉴定

目的:筛选食管癌广泛高表达蛋白COX-2的HLA-A2/A3限制性广谱CTL表位。方法:运用生物信息学的方法,设计出P66(COX-266-74FLKPTPNTV)和P479(COX-2479-487ALYGDIDAV)两条新的抗原肽。Fmoc固相合成法合成抗原肽,对其与HLA-A2.1和HLA-A3分子的结合力和稳定性进行分析,以MTT实验检测其对三种肿瘤细胞的杀伤作用。结果P479对HLA-A2.1及HLA-A3均有较高的结合力,而P66结合力较低。P479对COX-2 的EC-9706、EC-1的表现出明显的诱导杀伤作用,而P66没有表现出明显的作随着肿瘤分子免疫学与分子生物学研究     

展示p53蛋白表位噬菌体phage-SD的制备及应用

[目的]利用噬菌体展示技术制备一种可用于检测血清p53抗体的噬菌体.[方法]利用基因工程手段将编码p53蛋白N端20～31位的多肽SD的基因克隆到丝状噬菌体载体fADL-le的pIII蛋白基因中，制备展示该外源肽的噬菌体phage-SD并进行了Western blot鉴定.在此基础上，分别以phage-SD和重组p53蛋白为检测抗原，利用ELISA方法对乳腺癌患者血清p53抗体进行检测.[结果]成功制备出能特异性识别血清p53抗体的噬菌体phage-SD.ELISA检测结果表明，60例乳腺癌患者中phage-SD检测到13例p53抗体阳性患者，检出率为21.67%,与重组p53蛋白检测效率(21.67%)一致.[结论]成功制备一种灵敏度高、特异性强的可用于血清p53抗体检测的噬菌体phage-SD,为新型血清p53抗体检测试剂的开发及临床应用奠定基础.     

HLA高分辨等位基因多态性及单倍体与广西汉族终末期肾病易感性的相关性分析

为研究广西汉族终末期肾病(End Stage Renal Disease, ESRD)与人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen, HLA)等位基因及单倍体的关联性,本研究采用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸(Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Oligonucleotides, PCR-SSO)技术对广西汉族578例终末期肾病患者(ESRD组)进行HLA-A、B和DRB1基因分型,HLA等位基因频率用直接计数法来计算,采用Arlequin 3.5.2.2软件计算单倍型频率,并与1 644例广西汉族健康造血干细胞捐献者(对照组)比较。结果显示,ESRD组HLA-A*11:01、A*02:01、B*13:01、DRB1*12:02、DRB1*04:05、DRB1*14:54和DRB1*11:01的基因频率大于对照组(P<0.05),HLA-A*11:02、A*30:01、A*32:01、B*13:02、B*07:02、DRB1*07:01和DRB1*13:02的基因频率小于对照组(P<0.05)。ESR...     

胶质瘤Hsp70-肽复合物激活T淋巴细胞抗肿瘤研究

目的 研究胶质瘤Hsp70-肽复合物激活的T淋巴细胞抗肿瘤效应、探讨其用于临床治疗的可行性.方法 取胶质瘤手术标本,经组织块法培养、建株胶质瘤细胞,冻融法获取胶质瘤细胞抗原,抗原与Hsp70体外构建Hsp70-肽复合物并激活T淋巴细胞,制备特异性CTL,MTT法检测对胶质瘤细胞的体外杀伤作用.结果 Hsp70-肽复合物激活CTL对胶质瘤细胞的杀伤活性明显高于未经胶质瘤抗原激活的CTL对胶质瘤细胞的杀伤作用( P ＜ 0.01).结论 肿瘤组织中或细胞中提取的Hsp70-肽复合物作用于T淋巴细胞,能诱导CTL在体外对胶质瘤细胞能产生高效而特异杀伤作用,为临床制备肿瘤疫苗奠定理论基础.     

HLA-A*0201限制性CTL表位肽的分子力场分析

运用比较分子力场(CoMFA)和比较相似性指数分析(CoMSIA)方法研究了50个HLA-A* 0201限制性CTL表位九肽结构与亲和性间的关系,另外15个表位九肽作为预测集用于检验模型的预测能力。结果表明,采用CoMSIA得到的构效关系模型(q2 =0.608,r2 =0.987,F=440.4,SD=0. 111)要明显优于采用CoMFA得到的构效关系模型。在CoMSIA计算中,当引入疏水场时,三维构效关系模型得到明显改善,通过该三维构效关系模型,可较精确地估算预测集中15个CTL表位肽与HLA-A* 0201间的亲和力(r2pred=0. 703,SD=0. 368)。通过分析分子场等势面图在空间的分布,可以观察到表位肽分子周围的立体及疏水特征对表位肽与HLA-A* 0201间结合亲和力的影响,从而为进一步对CTL表位肽进行结构改造并基于此进行治疗性疫苗分子设计提供理论基础。     

利用经修饰的survivin短肽体外诱导对胃癌细胞系具有限制性杀伤作用的特异性细胞毒性T细胞

采用一种简单有效的方法体外诱导经修饰的survivin短肽特异性细胞毒性T细胞,并观察其对胃癌细胞的杀伤作用。选取对HLA-A2分子亲和力更高的survivin短肽(96—104,LLLGEFLKL,HLA-A2限制性)以更有效地诱导特异性T细胞。选取正常志愿者外周血单核细胞,筛选其中HLA-A2+者,利用HLA-A2/survivin短肽有效诱导特异性细胞毒性T细胞。Pentamer实验检测特异性细胞毒性T细胞比率。Elispot实验检测细胞毒性T细胞IFN-γ分泌能力。选取胃癌细胞系MKN28、SGC7901及KATO Ⅲ,检测其HLA-A2和survivin表达情况。检测特异性细胞毒性T细胞对三种细胞系的杀伤效果。Pentamer实验结果显示,HLA-A2/survivin短肽刺激之前短肽/HLA Pentamer和CD8双阳性细胞仅为0.06%,接受刺激后双阳性细胞增加到27.5%。Elispot实验结果显示HLA-A2/survivin短肽刺激后IFN-γ分泌细胞比率明显强于阴性对照组。PCR结果显示,KATO Ⅲ为HLA-A2+,MKN28和SGC7901为HLA-A2-。Western Blotting结果显示KATO III和SGC7901为survivin阳性,MKN28为survivin阴性。特异性细胞毒性T细胞杀伤结果显示,细胞能有效杀伤KATO III细胞,但对其他两种细胞杀伤效果不明显。p<0.01。经修饰的survivin短肽能够有效诱导特异性细胞毒性T细胞,并对胃癌细胞系有HLA-A2/survivin限制性杀伤。     

基于改进的人工神经网络方法预测CTL表位

为简化细胞病毒T细胞(cytotoxicity T lymphocytek, CTL)表位鉴定方法,应用改进的人工神经网络方法定量研究了短肽与MHC(major histocompatibility complex)分子结合亲合力的关系,并建立了CTL表位的预测模型,得到了预测模型最优性能参数.用此模型对短肽与HLA-A*0201分子结合的805个预测样本进行了预测,预测准确度达到73.8%.对来自黑色素MAGE-2的短肽与MHC分子的结合亲合力也进行了预测,结果较好.     

小鼠H-2D~b-BSP融合基因的构建与表达

目的:构建小鼠H-2Db-BSP融合基因,并诱导其在大肠杆菌中表达.方法:采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠淋巴细胞中扩增出H-2Db链的胞外段基因,经双酶切置换已构建的HLA-A*0201-BSP重组体中的HLA-A*0201胞外段序列,使H-2Db与BirA酶底物肽(BSP)序列融合,构建H-2Db-BSP融合基因表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导融合蛋白表达.结果:构建的H-2Db-BSP融合基因插入正确且序列与GenBank一致;经1mmol/L浓度的IPTG诱导后4h蛋白表达达到高峰,且融合蛋白以包涵体形式存在.结论:成功构建H-2Db-BSP融合基因,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步构建H-2Db四聚体,研究T细胞应答提供了物质基础.     

表达肿瘤抗原HPV-58 E7的HLA-A*0201阳性宫颈癌细胞模型的构建和鉴定

为建立内源性表达58型人乳头瘤病毒(Huamn papillomavirus type 58,HPV-58)重要癌抗原E7蛋白的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型.以HPV-58全基因组为模板,采用PCR法扩增E7蛋白的编码基因,构建真核表达载体pEGFP-N2-HPV58E7;转化大肠杆菌DH5α,通过DNA测序鉴定质粒载体;经除内毒素纯化后,将大量制备的重组质粒瞬时转染293T细胞,采用RT-PCR和细胞免疫荧光方法研究重组质粒在人源细胞中的表达情况;最后,选择HPV检出阴性的HLA-A*0201阳性人宫颈癌C33A细胞株为宿主细胞,采用脂质体转染、G418抗性加压筛选和细胞克隆化培养技术,建立能够稳定表达HPV-58 E7的恒定转染细胞株.采用RT-PCR、Western-blot和细胞增殖测定等方法从转录、翻译和表型等3个层次对所建细胞株进行鉴定研究.研究结果显示:克隆制备了HPV-58 E7蛋白的编码基因;构建获得了能够在人源细胞中表达HPV58E7-EGFP融合蛋白的真核表达质粒;并成功建立了能够稳定表达HPV-58 E7的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型;核酸和蛋白水平的鉴定结果表明所建模型细胞能够表达HPV-58 E7癌抗原,宿主细胞本身表达的Ⅰ类组织相容性抗原HLA-A*0201有望通过内源性抗原加工途径将E7抗原的细胞毒性T细胞(Cytotoxic lyphocyte,CTL)表位提呈到细胞表面;另外,细胞增殖试验结果亦表明该细胞模型体现出E7蛋白显著的诱导细胞增殖的生物学特征.总之,能够稳定表达HPV-58 E7癌蛋白的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型的建立为后续即将展开的以HPV-58 E7为靶标的宫颈癌治疗性疫苗和药物的寻找和研究奠定基础.