大肠杆菌染色体复制起始调控

大肠杆菌染色体具唯一一个复制原点叫oriC.在oriC上染色体的复制起始是个严格控制的细胞过程.首先,复制起始蛋白DnaA与oriC上DnaA框相互作用,使DNA分子弯曲,并在IHF和HU等蛋白的帮助下,使oriC双链DNA在其富含AT区解链,便起始复制.DnaA蛋白有两种形式,即ATP-DnaA和ADP-DnaA,前者有复制起始活性,后者则没有.DnaA蛋白浓度的提高和由DRAS使ADP-DnaA激活为ATP-DnaA都会导致额外的复制起始,说明ATP-DnaA是个复制起始正调控因子.DiaA蛋白通过与ATP-DnaA的相互作用来促使ATP-DnaA-oriC复合物的形成,从而激发复制起始.然而,在每个细胞周期中,DNA复制起始只发生一次.有不同的分子机制抑制在同一个细胞周期的同一复制原点上重复起始复制.1)复制原点的隔绝防止复制起始.由SeqA蛋白结合在oriC中半甲基化的多个GATC位点,使oriC失去复制起始活性;2)由RIDA使ATP-DnaA降解为ADP-DnaA,使DnaA失去复制起始活性;3)Dps蛋白抑制依赖DnaA蛋白的oriC解链;4)datA序列通过降低作用于oriC的DnaA可用量来延缓复制起始时间.显然,一个复杂的调控网络控制着复制起始.本文回顾、总结和分析了大肠杆菌复制起始调控机制.     

Control of Initiation of Chromosomal Replication in Escherichia coli

大肠杆菌染色体具唯一一个复制原点叫oriC.在oriC上染色体的复制起始是个严格控制的细胞过程.首先,复制起始蛋白DnaA与oriC上DnaA框相互作用,使DNA分子弯曲,并在IHF和HU等蛋白的帮助下,使oriC双链DNA在其富含AT区解链,便起始复制.DnaA蛋白有两种形式,即ATP-DnaA和ADP-DnaA,前者有复制起始活性,后者则没有.DnaA蛋白浓度的提高和由DRAS使ADP-DnaA激活为ATP-DnaA都会导致额外的复制起始,说明ATP-DnaA是个复制起始正调控因子.DiaA蛋白通过与ATP-DnaA的相互作用来促使ATPDnaA-oriC复合物的形成,从而激发复制起始.然而,在每个细胞周期中,DNA复制起始只发生一次.有不同的分子机制抑制在同一个细胞周期的同一复制原点上重复起始复制.1)复制原点的隔绝防止复制起始.由SeqA蛋白结合在oriC中半甲基化的多个GATC位点,使oriC失去复制起始活性;2)由RIDA使ATP-DnaA降解为ADP-DnaA,使DnaA失去复制起始活性;3)Dps蛋白抑制依赖DnaA蛋白的oriC解链;4)datA序列通过降低作用于oriC的DnaA可用量来延缓复制起始时间.显然,一个复杂的调控网络控制着复制起始.本文回顾、总结和分析了大肠杆菌复制起始调控机制.     

异形胞发育的蓝细菌DnaA蛋白的表达研究

为了研究DNA复制与Anabaena sp. PCC7120异形胞发育之间的关系.构建了Anabaena PCC7120的复制起始蛋白DnaA的重组表达质粒,在Escherichia coli中诱导其超量表达,纯化后免疫家兔获得抗体,采用Western blotting检测DnaA在营养细胞和异形胞中的表达情况.结果显示,两种不同类型的细胞中都能够检测到DnaA的表达,而且在不同缺氮诱导时间,异形胞中DnaA的表达存在差异.这说明DNA复制起始与异形胞的发育可能存在着一定的关系.     

真核生物DNA聚合酶δ的研究现状

DNA聚合酶δ(DNA polymerase δ)是真核生物DNA复制的主要复制酶,同时还参与DNA修复,对保持真核生物基因组的结构完整性和遗传稳定性具有重要作用.对DNA聚合酶δ蛋白功能活性及其基因表达机制的研究因受技术上的限制而未能深入研究.由于其重要的生物学功能,目前引起人们的更多关注和重视.文中就该酶的生物学功能、亚基组成、核心酶的分子表达调控以及与其他蛋白相互作用等方面对国内外DNA聚合酶δ的研究进行简要综述.     

DNA结合蛋白DbpA影响DNA聚合酶性能的研究

DNA聚合酶是催化DNA合成的酶,在体内和体外都具有重要的作用.在体内DNA聚合酶参与DNA的复制、损伤修复等,在体外DNA聚合酶是现代分子生物学重要的工具酶.Pfu DNA聚合酶因具有高保真性而被广泛使用,但延伸速度慢,提高其延伸速度将使其应用更加广泛.DbpA是古生菌Sulfolobus solfataricus细胞内含量丰富的非特异性双链DNA结合蛋白,分子质量8ku.本研究通过引物重叠延伸的方法得到密码子优化的DbpA基因,并构建得到Pfu-DbpA基因.结果表明:融合有DbpA蛋白的Pfu DNA聚合酶(Pfu-DbpA DNA聚合酶)自身的热稳定性不受影响,而延伸速度得到了提高;同时具有更高的耐盐性,说明具有更高的持续合成能力,并且能够适应更广泛的缓冲液体系.应用Pfu-DbpA DNA聚合酶扩增λDNA不同长度的片段,结果显示其比Pfu DNA聚合酶具有更好的应用效果.     

我国科学家揭示全新DNA复制起始位点调控机制

<正>DNA复制是一个确保遗传信息精确传递的生命过程。细胞在DNA合成前期G1期时,复制起始识别复合物识别染色质上的复制位点,进一步招募DNA解旋酶MCM(Minichromosome maintenance)等,形成复制前体复合物,完成复制起始位点的认证。而当细胞进入复制期S期时,被认证的复制起始位点被选择性地激活使用。真核生物DNA复制起始位点的选择受DNA序列和表观遗传因素共同调控。目前,表观遗传因素对染色质上DNA复制起始位点的选择机制仍然不清楚。     

增殖细胞核抗原（PCNA）的分子结构及其生物学功能研究进展

增殖细胞核抗原（PCNA）是真核生物复制复合体的核心成分，具有特殊的环状三级结构. 作为真核细胞DNA聚合酶δ的推动因子，与不同复制相关蛋白结合，协调DNA复制过程. 同时PCNA还作为功能转换因子，通过不同调控方式与多种细胞因子作用，参与了DNA损伤修复、细胞周期调控及凋亡等许多重要的细胞事件. 另外作为细胞增殖的指标，PCNA与肿瘤等细胞增殖性疾病的发生和发展存在相关性，因此在临床上对PCNA的深入研究有重要意义. 文中就PCNA的“功能性”结构及其在不同细胞事件中的功能转换（Function Switch）进行简要综述.     

DNA复制的忠实性

DNA复制的高度忠实性,保证了生物遗传的稳定性,是生物体的一种很重要的进化力。本文讨论了维持DNA复制高度忠实性的四个方面:(1)DNA聚合酶的选择作用;(2)DNA聚合酶的校正作用;(3)RNA引物的合成与切除是提高DNA复制准确性的重要因素;(4)DNA复制后错配碱基的修正。同时也指出了影响DNA复制忠实性的其它因素。     

异形胞发育的蓝细菌Dna A蛋白的表达研究

构建了Anabaena PCC7120的复制起始蛋白Dna A的重组表达质粒,在Escherichia coli中诱导其超量表达,纯化后免疫家兔获得抗体,采用Western blotting检测Dna A在营养细胞和异形胞中的表达情况.结果显示,两种不同类型的细胞中都能够检测到Dna A的表达,而且在不同缺氮诱导时间,异形胞中Dna A的表达存在差异.说明DNA复制起始与异形胞的发育可能存在着一定的关系.     

丝状真菌产黄青霉DNA提取方法的改进

为探索提取产黄青霉基因组DNA的简便方法,采用起始菌体量0.2 g,10 g/L十六烷基三甲基溴化铵裂解液,通过液氮/65℃反复冻融对菌种破壁,代替了液氮研磨,且不需要玻璃珠,操作简便,重复性好,提取的DNA质量高,极大地方便了后续基因操作.     

枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆及其在E.coli BL21(DE3)plysS中的表达

用CTAB法从枯草杆菌(纳豆株)中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得837bp的DNA片段,将该基因片断克隆到pMD18-T载体上,筛选重组子,通过限制性内切酶、PCR技术和测序分析确定该重组子所含插入片断为纳豆激酶基因．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的融合表达载体,转化E．coli BL21(DE3)plysS后经IPTG诱导在大肠杆菌中高效表达,经SDS—PAGE电泳及bandscan软件分析融合蛋白分子量约为33．4kD,约占菌体总蛋白29．4％．     

重组Pol D DNA聚合酶的纯化及其功能初步研究

为研究古菌Pol D DNA聚合酶两个亚基的功能及其相互作用,对重组超嗜热硫还原古菌Thermococcus sp.4557 Pol D DNA聚合酶小亚基DP1和大亚基DP2进行柱层析纯化,采用荧光标记核酸结合聚丙烯酰胺凝胶电泳实验对两个亚基体外功能进行研究。结果表明,DP2具有DNA复制延伸活性,DP1具有3''→5''外切核酸酶活性;DP1在与DP2的浓度比高于0.3∶1时可降解DP2的延伸产物;DP2对DP1的外切核酸酶活性有促进作用,Sld5和Psf1蛋白复合体(Sld5 and Psf1 Complex,GINS 51)对DP1的外切核酸酶活性有抑制作用。古菌Pol D DNA聚合酶大小亚基的功能及其相互作用对DNA复制机制的进一步认识有借鉴意义。     

外刊

<正>Cell曾几何时,科学家们认为,RNA聚合酶——通过将DNA转录成RNA开启蛋白质合成的分子,就像一个发条玩具那样工作:它置于我们DNA中的一个起始位点上,一直稳步急速运作,抽出一个RNA拷贝,直到它到达停靠位置。最近,科学家们意识到,他们没有给予RNA聚合酶足够的认识。     

火球菌复制蛋白A的表达纯化和活性研究

将火球菌(Pyrococcus furiosus)的3个复制蛋白A相关基因pfuRPA41(PF2020),pfuRPA32(PF2018),pfuRPA14(PF2019)克隆到pDEST17质粒,并在E.coli Rosetta(DE3)表达菌株中成功表达,最终通过固定化镍离子亲和层析分别得到纯度较高的三个复制蛋白A相关蛋白,对它们的单链DNA结合活性进行了详细测试.其中单独的pfuRPA41能结合单链DNA,而单独的pfuRPA32以及pfuRPA14不能结合单链DNA;然而pfuRPA32能够促进pfuRPA41的单链DNA结合能力.同时单链DNA长度对pfuRPA41结合单链DNA的能力有显著影响;在一定长度范围内,pfuRPA41结合单链DNA能力与单链DNA长度成正比.     

栖热菌(Thermus)的DNA转化研究

由栖热菌FDB8(Thermus sp.FDB8)提取的染色体DNA对栖热菌FD3009(Thermus sp.FD3009)进行了转化.用丝裂霉素C选择培养基对转化子进行选择,共获得3个转化子.它们的菌落色泽、对丝裂霉素C的抗性强度和耐热DNA聚合酶活性均介于供体菌和受体菌之间,而其菌体生长速度和破壁难易程度则优于供体菌和受体菌.结果表明,转化子是由供体菌FDB8的染色体DNA转化了受体菌FD3009所致,同时还可由转化子进一步选育出抗丝裂霉素C的耐热DNA聚合酶高产菌株.     

多胺在真核生物DNA复制过程中对聚合酶和解旋酶的作用

多胺存在于一切细胞中,调控着细胞的生长、增殖、分裂和分化.本文着重阐述了多胶在真核生物DNA复制过程中对聚合酶和解旋酶的作用.     

中心蛋白3定位于游仆虫细胞中形成棘毛的基体上

中心蛋白与中心体(或基体)有着密切关系,作为一种细胞骨架蛋白,形成原生动物巨大的细胞骨架网络;为了研究从八肋游仆虫细胞中克隆到的一种中心蛋白基因(EoCen3)的功能,我们构建了八肋游仆虫细胞大核人工染色体pBTub-Tel,定位分析该基因所表达的中心蛋白在细胞中的分布和行为.该人工染色体利用密码子优化的增强型绿色荧光蛋白基因作为标记,在八肋游仆虫细胞中实现高表达,避免用抗生素作为标记对该细胞的喂养产生影响.定位结果显示,该类中心蛋白特异定位于游仆虫形态发生过程中的基体上.在八肋游仆虫无性生殖细胞分裂的起始阶段基体开始发育,首先形成第一个基体,Eo-Cen3定位于新形成的基体中;随后基体开始复制,EoCen3定位于正在复制的基体中.在细胞发育过程中绿色荧光标记的基体成倍增加,说明EoCen3与参与棘毛形成的基体的复制有一定的关系.     

固相合成蛋白所需生物大分子Linker-Met和fma-tRNA的构建（英文）

无细胞表达蛋白质体系近年来恢复活力,以满足日益增长的蛋白合成需求.与传统的细胞重组表达蛋白的方法相比,无细胞体系具有许多优点,包括更快的速度、更高的通量和更大的灵活性.此外,它提供了独特的可能性,如合理的DNA模板设计,毒素蛋白的表达,多个多肽链的联合表达,高效的定位标记等等.在本文中,建立了一个linker-tRNA的方法利用无细胞体系固相合成蛋白质.首先,需要将第1个氨基酸连接上起始tRNA通过linker连接到固相表面.为了提高固相合成蛋白质的效率,利用含有琥珀终止子(CUA)为反密码子的linker-tRNA与含互补琥珀子(UAG)为起始密码子的DNA模板而不是正常的起始密码子(密码子AUG).已经成功地获得了纯化的fma-tRNA(-CA)和linker-Met了.此方法将为蛋白质芯片的开发提供新途径.     

转录辅助复合体SAGA成分蛋白作用的研究进展

真核细胞中承载基因的染色质是一种非常精密而严谨的结构.这种DNA高度压缩、复杂的染色质结构影响了转录因子和RNA聚合醇Ⅱ等基本转录机器结合到相应的DNA位点上.因此基因要转录激活就必须借助于转录辅助复合体消除染色质的结构抑.转录辅助复合体可以分为两类一类主要是利用水解ATP来改变核小体相对于DNA序列的缠绕方式及排列;另一类是通过对核心组蛋白进行共价修饰来改变核小体和DNA的结合能力.SAGA复合体属于后者,对红蛋白具有乙酰化的作用.酵母中的SAGA复合体是一个分子量为180万道尔顿的多功能蛋白复合体,本文将着重介绍SAGA复合体成分蛋白在真核生物基因转录起始中的作用.     

乙型肝炎病毒聚合酶基因在重组腺病毒系统中的表达

乙型肝炎病毒是一种重要的人类病原,乙肝病毒聚合酶在病毒的复制中具有关键作用．拼接了HBV56的聚合酶全长基因,利用重组腺病毒系统,在HEK293细胞中表达乙肝病毒聚合酶．通过一种半定量PCR方法,检测到所表达的蛋白具有逆转录酶活性．这一研究对深入认识该酶结构与功能的关系,研制抑制病毒复制的药物,有一定的意义．