N-磷酰化氨基酸在溶液中的定向成肽反应

N-磷酰化氨基酸在没有缩合试剂的水溶液中能够与氨基酸发生成肽反应，利用葡聚糖凝胶柱分离，用电喷雾二级质谱（ESIMS/MS）对产物进行鉴定和分析，结果表明，所有反应体系中均有磷酰化二肽生成，且成肽反应具有方向性；成肽产物的N端氨基酸来自N-磷酰化氨基酸，成肽反应发生在其C端，另外，成肽产物中只有α-羧基参与形成的磷酰化二肽，这表明N-磷酰化对氨基酸羧基的成肽反应具有显著的选择性。量化计算表明室温下溶液中N-磷酰化氨基酸成肽的反应是可行的，溶液中N-磷酰化氨基酸的成肽反应规律对蛋白质起源和生物合成的研究具有启发意义。     

多肽抗菌素的生物合成

一、引言生物合成的抗菌素中来源于氨基酸结构单位的,可分为由一个氨基酸残基组成的抗菌素,如D-环丝氨酸、氮杂丝氨酸、6-重氮-5-氧-L-去甲基亮氨酸、硫藤黄菌素和金丝霉素等;由二个氨基酸残基组成的二肽抗菌素,如青霉素、头孢菌素C等;和含二个以上氨基酸的多肽抗菌素。文献上已报道了300多个多肽抗菌素,其中40多个的结构已基本定出,10多个已全合成而最后证明了结构。     

PNPase酶促合成多核苷酸的研究

作者曾报道用多核苷酸磷酸化酶(PNPase)使寡核苷酸进行3′端磷酰化的方法.本文发展了这一方法,将它应用于合成一定序列的多核苷酸.其原理是利用PNPase 将某核苷二磷酸与7甲基鸟苷二磷酸(~(m~7)GDP)在引物存在下共聚,然后再选择性地消去聚合物中的7甲基鸟嘌呤残基,这样就可以限制性地在引物的3′端引入一定数目的其他核苷酸.被引入的核苷酸的数目可以用加入核苷二磷酸与     

两种新晶型的去五肽(B_(26—30))胰岛素晶体学研究

B链羧端去五肽(B_(26-30))胰岛素(简称DPI)是研究胰岛素结构与功能关系的一个重要的胰岛素类似物。生物化学研究表明,DPI虽然比胰岛素少近十分之一的氨基酸残基,却仍然保持相当高的胰岛素活力;而由DPI再去两肽(B_(24-25))的去七肽胰岛素则几乎完全丧失胰岛素的生物活力。许多研究都指出,胰岛素的B_(24),B_(25)残基对于胰岛素功能的发挥是非常重要     

蛋白质翻译后修饰在蛋白质-蛋白质相互作用中的调控作用

蛋白质-蛋白质相互作用是蛋白质发挥功能的主要机制之一,在DNA损伤修复、自噬和代谢等过程中都扮演着非常重要的角色,蛋白相互作用异常便会导致肿瘤等疾病的发生.在蛋白质的赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸等氨基酸残基上,可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等200多种翻译后修饰,这些修饰通常能改变蛋白质的电性、疏水性和空间结构等属性,为与之结合的蛋白提供结合的锚定或产生位阻效应,像一把开关在时空上精确调控蛋白质-蛋白质相互作用的发生以及动态变化.结构研究表明,蛋白质之间的相互作用通常由临近的几个氨基酸残基直接结合,替换该区域的氨基酸残基,通常能破坏结合,使其失去部分功能或酶活性,可以针对性地开发和设计抑制剂或激活剂,用于肿瘤等疾病的治疗.本文简要介绍了蛋白质翻译后修饰在蛋白质-蛋白质相互作用中的调控作用,以及发挥的重要生理功能.     

水疱性口炎病毒L蛋白N端存在新的定位信号

水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV) L蛋白是该病毒复制酶的主要成分, 分子量约为241 kD. 通过构建L蛋白缺失突变体与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的方式, 将融合蛋白置于T7启动子或CMV启动子下游, 在多种动物细胞中瞬时表达了重组的融合蛋白. 荧光显微镜观察结果显示, 仅保留N端96个氨基酸残基或缺失N端120个以上残基时, 融合蛋白均匀分布于整个细胞质中, 而含有N端120个以上残基时, 融合蛋白呈点状或局部分布于核周围部位. 截取L蛋白96～120氨基酸片段, 连接到GFP蛋白氨基端, 同样融合蛋白亦特异性地分布到核周围局部区域. 进一步研究含定位信号的25个残基片段发现, 仅13个残基的肽段QGYSFLHEVDKEA(108 ~ 120)就具有定位功能, 缺失D或V均导致定位信号完全丧失. 含有这13个残基的GFP融合蛋白, 在多种细胞和不同表达模式下均显示了同样的分布规律, 表明L蛋白N端这种定位信号具有独立的定位功能, 并且在不同细胞中是保守的.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

·OH自由基诱导氧化磷酰化甲硫氨酸的pH效应

近年来,甲硫氨酸的辐射化学研究十分活跃,这是因为甲硫氨酸能快速清除·OH自由基而具有对生物的辐射保护作用。生物大分子的磷酰化作用亦越来越受重视,众所周知,在DNA和RNA中,磷酸酯是储存和传输能量的“生物能源库”;近年来基因调控研究的重大进展在于发现了蛋白质的可逆磷酰化作用,不仅是酶活性调节、基因表达调控、细胞生长调节等的关键环节,而且在解决肿瘤的发生与治疗、抗辐射损伤及抗衰老方面具有特殊作用。另外,磷酰化氨基酸及小肽已被证明具有药物性能。氨基酸是蛋白质的基本结构单位,因此研究磷酰化氨基酸的辐解机理对了解生物大分子磷酰化作用具有重要意义。     

SGK和14-3-3蛋白与TPO/MPL信号传导的丝氨酸/苏氨酸磷酸化机制有关

血小板生成素(thrombopoietin, TPO)是调节血小板生成最主要的细胞因子, 它的生物学效应由其受体c-Mpl介导. 用酵母双杂合系统(two-hybrid system)筛选了与c-Mpl膜内部分相互作用的蛋白质. 在5×106个转化子中, 得到48个阳性克隆. 测序结果表明, 其中一个是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SGK (serum and glucocorticoid-inducible kinase)的部分编码序列(编码第246位氨基酸至C末端, 包括3′端非编码区); 另一个为14-3-3 theta亚型蛋白的部分编码序列(编码第67位氨基酸至C末端, 包括3′端非编码区). 体外GST-Pulldown分析和免疫共沉淀进一步证实了c-Mpl与它们的相互作用. 通过系列缺失研究发现两个蛋白与c-Mpl相互作用的区域都在523~554 aa范围内. 用酵母双杂合系统进一步研究SGK和14-3-3蛋白之间的关系, 发现两者可能直接相互作用. SGK和14-3-3蛋白可能与TPO/MPL信号传导过程中的丝氨酸/苏氨酸磷酸化有关.     

一个东亚钳蝎K+通道阻断剂cDNA的克隆和序列分析

蝎毒液中的K⁺通道阻断剂对于研究细胞特定K⁺通道的药理学特性和生理学作用具有重要的价值 .根据已报道的一种Ca^{2 +}激活K⁺通道阻断剂BmP0 1的氨基酸序列设计1对“背对背”简并引物 ,运用反向PCR策略从中国东亚钳蝎毒腺组织中首次克隆到其全长cDNA ,它由 5′UTR ,ORF和 3′UTR 3个部分组成 .翻译起始密码子ATG旁侧序列AAAATGA在蝎Na⁺通道毒素和原生生物基因中高度保守 ,表明这类基因可能存在共同的翻译起始机制 ;3′UTR含有poly(A)信号 .ORF编码57个氨基酸残基 ,N端28个残基为信号肽序列 ,富含疏水性氨基酸 ,其长度显著不同于已报道的蝎Na⁺通道毒素信号肽 ,C端29个残基为成熟毒素 ,其氨基酸序列与天然BmP0 1完全一致 .     

水稻花优势表达基因RA68的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻花中克隆了1个编码含丰富脯氨酸和苏氨酸结构域多肽的cDNA, 其相应的基因命名为RA68. RA68含3个外显子和2个内含子, 编码由219个氨基酸残基组成的蛋白质. 数据分析结果显示, 该蛋白由1个22个氨基酸残基组成的信号肽, 1个亲水性的N-端结构域和1个疏水性的C-端结构域组成. N-端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列. Southern blot和序列分析结果表明, RA68在水稻基因组以单拷贝存在, 定位于第2号染色体. Northern杂交结果表明, RA68在幼芽和花中表达量较高, 在根和叶中不表达. 花和幼芽进行原位杂交分析结果表明, 在花中, RA68在花粉母细胞、二分体细胞、单核花粉粒以及大孢子囊中表达. 基于该基因的表达特性及其编码蛋白质的结构特征, 探讨了其在花发育中的可能功能.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

叶绿体ATP合酶ε亚基缺失突变对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度及其ATP合成能力的影响

在E. coli中表达菠菜叶绿体ATP合酶ε亚基及其N端或C端部分氨基酸残基缺失突变体的蛋白. 经初步纯化, 测定将它们加入到叶绿体悬浮液中后对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度及其循环和非循环光合磷酸化活力的影响, 以及它们与缺失ε亚基的类囊体膜重组后的ATP合成活力. 结果显示, 外加ε亚基或缺失突变的ε亚基蛋白于叶绿体悬浮液中对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度和光合磷酸化活力均有促进作用. N端缺失突变的ε亚基随着其缺失氨基酸残基数目的增加(从1→5个), 对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度和光合磷酸化活力的促进作用逐渐减弱, 且与缺失ε亚基的类囊体膜重组后的ATP合成活力也逐渐减小; 但是C端缺失突变的ε亚基随着其缺失氨基酸残基数目的增加(从6→10个), 其促进作用反而逐渐增强, 且与缺失ε亚基的类囊体膜重组后的ATP合成活力也逐渐增大, 但均仍不如野生型ε亚基的高. 这些结果表明, 叶绿体ATP合酶ε亚基的N端结构可通过调节ε亚基的堵塞跨膜质子泄漏能力影响合酶的ATP合成能力, 叶绿体ATP合酶ε亚基C端区域对于ATP的合成具有微妙的调节作用.     

A1-(D-丙氨酸)胰岛素初步晶体学研究

活力不同的胰岛素以及—级结构上不同部位化学修饰的胰岛素和围绕各种不同稳定性或不同效率而进行的分子改造胰岛素的研究是目前阐明胰岛素结构与功能之间关系的最有效手段之一.研究结果表明:在维持胰岛素生物活力上,胰岛素A链N端A1-Gly有举足轻重的作用.Krail和Geiger等人曾先后对胰岛素A链N端A1-Gly用不同构型的氨基酸取代,制备了一系列Al-位置由不同氨基酸残基置换的胰岛素修饰物,以探讨它们与生物活力之间的关系.用L和D构型氨基酸取代A1-Gly以后,所有L构型氨基酸取代的修饰胰岛素的活力严重降低到原胰岛素生物活力的10%左右,而所有由D构型氨基酸取代的胰岛素修饰物     

HPLC在线二阶微分光谱法检测基因工程产品的C-端肽

遗传工程重组蛋白质N-端序列和C-端序列分析是鉴定其结构特征的2项重要的指标.N-端的序列分析即采用经典的Edman方法,在商品化的仪器上自动分析50个以内的N-端氨基酸残基,已经是一种常规方法,近年来技术发展可以通过SDS-PAGE电泳印迹到PVDF膜上,在膜上直接分析蛋白的N-端序列,不但可以用来测定产品的顺序,而且为检验基因工程培养物是否与预期表达产物相吻合提供了一个相当简便的方法.     

氨基酸残基手性对肽基水凝胶性能的影响

肽基水凝胶作为一种可降解、生物相容性良好的生物材料,其氨基酸残基手性对水凝胶性能具有显著影响.一般情况下,在水凝胶骨架中引入D型氨基酸残基会增强水凝胶对蛋白酶水解的抵抗性,以及增强材料在宿主体内的免疫响应.同时,不同残基手性也会对细胞行为,如干细胞分化、骨修复,以及水凝胶的凝血、抗菌和抗肿瘤性能产生明显的影响.本文综述了近年来氨基酸残基手性在影响肽基水凝胶性能方面的研究,针对开环聚合获得的聚肽和缩合方法(包括固相合成)制备的寡肽与多肽等材料,重点阐述了氨基酸残基手性对肽分子及其水凝胶的二级结构、凝胶化性能、降解、免疫响应等性质,以及体外细胞行为、体内组织再生、抗菌性能和抗肿瘤作用等生物医学应用方面的影响.     

人参中γ-氨基丁酸的分离、鉴定及氨基酸的定量分析

人参水溶性化学成分的研究,自从Gstirner开始后,引起了各国科学家的重视.作者在人参水溶性化学成分的研究工作中,首次从人参中分离纯化并鉴定了一个重要的神经传导递质,非蛋白氨基酸,γ-氨基丁酸(GABA)的存在,同时还首次分离鉴定了N端为Glu并以γ-羧基形成肽键的几个寡肽.本文报道GABA的分离与鉴定及以不同形式存在的氨基酸分析.     

应用多波长反常散射法测定耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶的晶体结构

运用基因工程技术,将耐热邻苯二酚2,3－双加氧酶（TC23O）分子中的甲硫氨酸（Met）全部置换为甲硒氨酸（SeMet）。培养出甲硒氨酸置换的耐热邻苯二酚2,3－双加氧酶（SeMet-TC23O）的晶体,利用同步辐射光源收集了SeMet-TC23O晶体的X射线衍射数据,应用多波长反常散射方法测定了TC23O0.3mm的晶体结构。结果显示,TC23O分子为同源四聚体结构,每个单体由相对独立的N－端结构域（1－153位氨基酸残基）和C－端结构域（153－319位氨基酸残基）构成。每个结构域含有两个在此类酶中具有特征性的βαβββ结构花样,两个结构域可根据分子内非晶体学对称轴近似叠合。     

葡萄球菌核酸酶R型N端片段:SNR141的晶体生长及初步晶体学分析

葡萄球菌核酸酶(SNase A,EC3.1.4.7)由149个氨基酸残基组成(分子量16.807ku),不含巯基和二硫键,它水解DNA和RNA的磷酸酯键并释放出3’-磷酸单核苷酸和二核苷酸SNase A最初从金黄色葡萄球菌中得到,随后这个酶的基因被克隆并在若干表达体系中进行表达.它的晶体结构已在高分辨率测得,结构表明它唯一的色氨酸残基(W140)包埋在一个疏水环境中.SNase A一直作为研究酶学、蛋白质热力学稳定性以及肽链折叠动力学的     

猪胰脂肪酶在单相有机溶剂中催化酯交换反应拆分DL-苯丙氨酸

近年来,随着酶工程研究的发展,酶在有机溶剂中的应用变得广泛.利用酶反应的立体选择性、区域选择性对许多醇、酯进行了光学拆分.其中也有报道利用酶在有机相中拆分氨基酸的结果,如α-胰凝乳蛋白酶在甲苯-水双相体系中拆分DL-苯丙氨酸甲酯,此反应实际上是水相进行的水解反应;α-胰凝乳蛋白酶在甲醇中催化DL-苯丙氨酸异丙醇酯和甲醇的酯交换反应,此反应酶存在于水相,反应过程必须随时控制pH;脂肪酶催化氨基酸N端