人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

SHV-12型超广谱β-内酰胺酶的原核表达及免疫原性分析

利用PCR技术扩增了SHV-12 ESBLs目的基因,并将目的基因亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET-28a-SHV-12转化于表达菌株BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳分析.结果表明,目的蛋白SHV-12 ESBLs相对分子质量为30 KDa,经蛋白质印迹检测证...     

重组人TRAIL胞外片段的原核表达系统选择及蛋白复性研究

采用PCR技术从人肝脏cDNA文库扩增出编码114～281位氨基酸的TRAIL基因片段,将之克隆至原核表达载体pET-30a、pQE-30和pJLA503中,上述重组载体经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE鉴定显示pET-30a系统表达效率最高,目的蛋白占菌体总蛋白含量的40%左右;采用透析法或梯度稀释法对TRAIL胞外区片段包涵体进行复性,非还原SDS-PAGE的结果显示梯度稀释法明显好于透析法;纯化后的TRAIL胞外区片段蛋白具有明显的生物学活性,效果与标准品相似;通过添加不同的折叠促进剂对复性效率影响的研究,确立了TRAIL胞外区片段适宜的复性方法,复性效率达75%～80%.     

AtbZIP19和AtbZIP23蛋白的原核表达

bZIP类转录因子参与调控多种生物学过程,包括植物生长、花的发育、种子的成熟、衰老、光信号传导、损伤修复、病菌防御以及对各种环境胁迫的响应等。文章构建AtbZIP19和AtbZIP23基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了蛋白表达;提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR克隆AtbZIP19与AtbZIP23基因cDNA全长;将pET-32a+载体和聚合酶链反应(PCR)产物进行双酶切,通过DNA连接反应将2个基因定向克隆到pET-32a+质粒中;经菌液PCR和测序鉴定获得阳性克隆后,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达得到目的蛋白。     

兔生长激素cDNA克隆和表达

从兔脑下垂体中的mRNA中,利用合成引物逆转录PCR,获得了前体和成熟生长激素的cDNA,成熟生长激素的cDNA克隆在pET-3a表达载体并转化到大肠杆菌BL21(DE3 plys)中,获得了高效表达,表达量达到大肠杆菌总蛋白的40%。     

程序性细胞死亡配体1胞外区原核重组表达、纯化及其多克隆抗体制备

为制备程序性细胞死亡配体1胞外区多肽及其鼠源性多克隆抗体,根据UniProtKB数据库中公布的其胞外区基因序列(标识符:Q9NZQ7-1)和原核表达载体pET-28a(+)Nde I上游和Xho I位点下游的序列,设计合成带有同源臂的特异性引物.以合成的PD-L1胞外区基因为模板,PCR扩增程序性细胞死亡配体1胞外区基因并将其克隆至pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-PD-L1-E,转化至大肠杆菌DH5α中,扩增并提取其质粒,然后将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达.亲和层析镍柱纯化重组蛋白后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,确认表达蛋白正确.浓缩换液后用重组蛋白免疫Balb/c品系小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测,成功获得抗程序性细胞死亡配体1胞外区血清.该研究对于研发某些肿瘤伴随诊断检测试剂有重要意义.     

BVDV-2 E2基因的原核表达及重组蛋白反应原性的研究

为了对BVDV进行诊断,根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆分离株SWE2基因进行扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入BL21（DE3）表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-28a-E2,并转化人大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为32ku;Westernblot分析表明该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性,为BVDV-2诊断试剂研发奠定基础。     

大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达

为了更好地研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的结构和功能,采用PCR(聚合酶链式反应)、双酶切和细胞转化等基因工程方法对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因进行克隆并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达分析,扩增出一个新的大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因,将其基因克隆到原核表达载体pET-30a上,并导入到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。通过IPTG诱导成功表达出大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。所提出的方法能够高效表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,为进一步大规模表达纯化和应用提供参考。     

人补体调节蛋白基因MCP和DAF的克隆及其在E. coli中的表达

人膜辅基蛋白MCP(membrane cofactor protein)和降解加速因子DAF(decay-accelerating factor)是免疫排斥反应中补体系统活性调节的重要蛋白．以PCR的方法分别从成人肝cDNA文库和胎儿骨髓cDNA文库中扩增得到MCP和DAF基因，克隆入载体pUC19，再以所构建质粒为模板，以PCR的方式在二基因间加入编码柔性连接肽的DNA序列，构建融合基因MCP-DAF，并克隆入pUCl9质粒．将MCP、DAF及MCP-DAF亚克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a( )或pET-32b( )，构建表达载体MCP-pET32a，DAF-pET32b及MCP-DAF-pET32a，分别导入E．coli BL21菌株中表达，得到预期分子质量大小的蛋白．     

幽门螺杆菌hpaA基因克隆及其蛋白的表达纯化

目的克隆幽门螺杆菌hpaA基因,构建hpaA-pET-32a重组质粒,并对其重组蛋白进行表达纯化,为其进一步的免疫研究提供实验基础.方法采用PCR方法,从幽门螺杆菌临床分离菌株中扩增hpaA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,通过表达载体pET-32a构建的hpaA的重组质粒,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,最后对重组蛋白进行纯化.结果重组质粒hpaA-pET-32a经双酶切、PCR及测序证明构建成功,经诱导重组蛋白成功表达,以包涵体蛋白的形式存在,对其纯化后获得了高纯度的重组蛋白.结论成功构建幽门螺杆菌hpaA的原核表达系统,并对其重组蛋白进行了表达纯化.     

果蝇血液发育基因Nfat的多克隆抗体的制备

Nfat基因在血液发育中具有重要作用.根据已报道的Nfat基因序列,以果蝇胚胎cDNA为模板,通过PCR扩增Nfat部分编码序列,并将其连接到pET-28A原核表达载体上,经过双酶切以及测序鉴定成功后,将重组质粒转化E.coli BL2l.在37℃时,通过IPTG诱导表达融合蛋白,通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,然后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blotting检测抗体的效价以及特异性.结果表明,获得的Nfat多克隆抗体特异性较强,为后期Nfat基因的研究工作奠定了基础.     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

斑马鱼Nfatc3基因多克隆抗体的制备及检测

为了在斑马鱼模型中更深入地研究Nfatc3蛋白在心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增斑马鱼Nfatc3基因的部分编码区并插入pET-28a表达载体中,之后将重组质粒转入大肠杆菌（E.coli）通过IPTG诱导表达His-Nfatc3融合蛋白,对该融合蛋白采用Ni-IDA凝胶柱层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多克隆抗体,并用western blotting对抗体进行分析.结果表明获得了高效价的特异性兔抗Nfatc3多克隆抗体.这为Nfatc3功能的进一步研究奠定了基础.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.     

顶头孢霉cefG基因的表达及抗体制备的研究

通过PCR方法得到带酶切位点的cefG基因,用于构建表达质粒pET30-G,并在大肠杆菌里成功表达出乙酰转移酶的包涵体。将该重组蛋白的标准品作为抗原,免疫BALB/c小鼠得到多克隆抗体,酶联免疫吸附测定(ELISA)分析得抗体的效价满足实验需求。利用该抗体绘制出抗原浓度的标准曲线,确定待测抗原适合的检测浓度在0.16μg/mL以下。制得的抗体在重组大肠杆菌里检测到了乙酰转移酶,证明所得抗体具有实验价值。     

恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

原核表达恶性疟原虫多期多表位基因并制备其多克隆抗体。在前期构建恶性疟原虫复合多期多表位重组真核表达载体的基础上,将测序正确的AMAMEG基因克隆入原核表达载体pGEX4T—1并诱导表达。采用包涵体洗涤的方式纯化目的蛋白,以AMA—1抗体对纯化蛋白进行Western—blot分析。将纯化的融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过PCR成功获得长度为1 000 bp的恶性疟原虫AMA—1胞外域基因片段,获得了与多表位基因连接后的AMAMEG基因。通过诱导表达,显示在相对分子量约95 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白。经此纯化的融合蛋白免疫的小鼠能产生特异性抗体,其滴度达到1∶105。纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型疟疾疫苗奠定一定的理论和实践基础。     

斑马鱼CFL基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析

在心脏发育过程中,相关基因的正常表达是有功能心脏形成的关键．斑马鱼CFL基因是从斑马鱼胚胎的cDNA文库中克隆出来的一个心脏发育候选基因．生物信息学分析表明：CFL基因编码278个氨基酸,含有一个CXXC结构域．为进一步研究该基因的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了该基因．将所得片段插入原核表达载体pET-28a载体中,经测序鉴定正确后转化入Rosetta菌株中,用IPTG诱导表达出pET-28a－CFL融合蛋白,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71％,融合蛋白相对分子质量约为30kD．经包涵体纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体．经验证,具有较好的特异性和较高的效价,可以用作western－blot免疫印迹等实验分析．     

花生AhAO2基因融合表达、纯化与抗体制备

研究构建AhAO2基因片段原核表达重组质粒pPROEX-Hta-AhAO2的实验结果显示,重组pPROEX-Hta-AhAO2表达质粒在E.coli BL21中高表达His-AhAO2融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化His-AhAO2免疫新西兰大白兔,获得抗His-AhAO2抗体,Western blot检测显示其只与His-AhAO2融合蛋白结合.实验成功制备了抗AhAO2特异抗体.     

AhAO2融合蛋白表达、纯化与抗体制备

构建AhAO2基因片段原核表达重组质粒pPROEX-Hta-AhAO2,表达质粒在E.coliBL21中诱导表达,获得His-AhAO2融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化His-AhAO2免疫,新西兰大白兔,获得抗His-AhAO2抗体,West-ern blot检测显示其只与His-AhAO2融合蛋白结合.实验成功制备了抗AhAO2特异抗体.